Разработка методов иммуноанализа с использованием магнитных наномаркеров, страница 4

При этом через каждый фильтрпропускается 30 мл образца. Суммарное время анализа составляет около 2 ч. Данный форматбыл назван концентрирующим МИА.На последующих этапах, одинаковых для обоих форматов, пропускание реагентовчерез твердую фазу осуществлялось циклами, как описано выше, с помощью системы15автоматического дозирования. Для демонстрации возможностей методики при пробахразличного объема в экспресс-МИА использовались пробы объемом 150 мкл (характерныйобъем пробы в традиционных иммуноанализах), а в концентрирующем МИА – 30 мл, т.е.объем, прокачиваемый через систему за 1,5 ч (процедура полного цикла анализа составила2 ч – характерное время современных количественных анализов).

Подчеркнем, чтовозможности метода не ограничены приведенными величинами, и анализ может бытьвыполнен в широком диапазоне значений объема анализируемых образцов.Рисунок 8. Схема и реализация магнитного иммуноанализа на волоконных фильтрах:А) – экспресс-МИА формат; Б) – концентрирующий МИА формат; 1 – поверхность фильтра,2 – иммобилизованные антитела, 3 – антиген, 4 – биотинилированные вторые антитела,5 – стрептавидин, 6 – магнитная наночастица.Полученные зависимости сигнала от концентрации токсинов для экспресс-МИА иконцентрирующего МИА представлены на рис. 9.

В формате экспресс-МИА минимальнодетектируемая концентрация, определенная по критерию 2σ, составила 0,3 нг/мл для СЭА и0,1 нг/мл для ТСТШ. Таким образом, при использовании объемов пробы, типичных длясовременных иммуноанализов, разработанный метод не уступает по чувствительностисуществующим ИФА-тестам. При этом время анализа (25 мин) в 3-5 раз меньше.Существенное сокращение времени анализа происходит за счет целого ряда факторов.Применяемыйрежимдозированияиммунореагентовчерезобъемныеструктурыобеспечивает активное турбулентное перемешивание и иммунофильтрацию вместопассивной молекулярной диффузии в традиционных методах. Кроме того, площадьповерхности в используемых объемных фильтрах почти на порядок превышает площадьтвердой фазы в стандартных ИФА-методах. Это позволяет сократить время инкубаций почтина два порядка при одинаковом объеме пробы.16Рисунок 9.

Калибровочные кривые определения стафилококковых токсинов в цельном молоке спомощью магнитного иммуноаналза: А) – стафилококковый энтеротоксин А; Б) – токсин синдроматканевого шока; красная левая линия – экспресс-МИА формат; зеленая правая линия –концентрирующий МИА форматВ формате концентрирующего МИА чувствительность составила 10 пг/мл для СЭА и 4пг/мл для ТСТШ. Таким образом, разработанный иммуноанализ в концентрирующемформате, продолжительность которого не превышает времени наиболее быстрых ИФАтестов, обеспечивает в 30 раз лучшую чувствительность. Значительное увеличениечувствительности происходит за счет концентрирования антигена из анализируемой пробыпутем иммунофильтрации на твердой фазе непосредственно в процессе анализа проббольшого объема. Таким образом, при увеличении объема пробы разработанныйиммуноанализ позволяет регистрировать меньшие концентрации детектируемого вещества.Разработанный метод обладает широким динамическим диапазоном (3-4 порядка), атакже большим углом наклона зависимости сигнала от концентрации, который близок кзначению 1,0 в логарифмическом масштабе.

Сочетание данных факторов позволяет увереннодетектировать антиген в области как низких, так и высоких концентраций.Установлено, что разработанный метод иммуноанализа не требует пробоподготовки,необходимой для большинства традиционных подходов, при анализе цельного молока. Длядемонстрации этой особенности был проведен концентрирующий МИА для 4х панелейобразцов, различающихсятолькоразбавлением:неразбавленноемолоко, 2-кратноеразведение, 4-кратное разведение и 20-кратное разведение в фосфатно-солевом буфере.Концентрация токсина в каждом из наборов составляла от 0 до 10 нг/мл. Был вычисленпредел детекции по критерию 2 σ.

Также был вычислен «эффективный» предел детекции,учитывающий разведение относительно исходного образца. «Эффективный» пределдетекции – минимальная концентрация токсина в необработанном молоке, которая можетбыть определена.17Зависимость пределов детекции от разбавления представлена на рис.

10. Как можнозаметить, предел детекции улучшается с 4 пг/мл до 3 пг/мл для ТСТШ и от 10 пг/мл до 8пг/мл для СЭА с изменением разбавления в 20 раз. Тем не менее, «эффективный» переделдетекции при этом ухудшается с 4 пг/мл до 57 пг/мл для ТСТШ и с 10 пг/мл до 151 пг/мл дляСЭА. Наблюдаемый эффект и для СЭА, и для ТСТШ показывает, что разбавление образца неприводит к улучшению характеристик иммуноанализа из-за существенного ухудшениячувствительности по отношению к токсину в начальном образце, безопасность которогонеобходимо проанализировать.Рисунок 10. Зависимость измеренного и эффективного (по отношению к реальным образцам)пределов детекции от кратности разбавления молока: А) – стафилококковый энтеротоксин А;Б) – токсин синдрома тканевого шокаПоказано, что центрифугирование также не приводит к улучшению предела детекции.При анализе жидкой фракции образца (при удалении сепарированных жирового слоя иосадка) специфический сигнал уменьшался на 7% для ТСТШ и на 10% для СЭА, а снижениянеспецифического сигнала практически не отмечалось.

Это, по-видимому, связано с тем, чтовудаленнойврезультатецентрифугированияфракциимолокаприсутствоваланезначительная доля антигена пробы.Показано, что чувствительность разработанного метода растет при увеличенииобъема анализируемой пробы. Исследована зависимость детектируемого сигнала отиспользуемого объема аналита в формате концентрирующего МИА, для чего образцыпрокачивались с помощью перистальтического насоса с различной скоростью в течение 15мин. Концентрация токсина во всех образцах была одинаковой и составляла 1 нг/мл как вслучае СЭА, так и для ТСТШ.

В качестве контроля использовались такие же образцы, но несодержащие токсина. Типичная зависимость величины специфического сигнала от объемаобразца показана на рис. 11. Как видно из рисунка, использование больших объемов пробыприводит к дальнейшему повышению чувствительности предлагаемого метода. Этот эффектобусловлен концентрированием антигена на антителах, иммобилизованных на пористойструктуре.18Установлено, что скорость нарастания специфического сигнала при увеличенииобъема пробы при детектировании обоих токсинов постепенно падает (рис.

11), посколькупри фиксированной концентрации и скорости прокачки антигена устанавливаетсяравновесное связывание антигена, обусловленное кинетикой ассоциации и диссоциациикомплекса антиген-антитело. При очень высоких скоростях прокачивания пробы сигналзависит уже не столько от объема образца, сколько от времени взаимодействияиммобилизованных антител с раствором. Как видно из рисунка, при относительно высокойскорости прокачки на уровне 1-3 мл/мин объем образца практически перестает влиять нарезультат анализа.

Данная характерная особенность позволяет избежать погрешностей,обусловленных различными скоростями прокачивания при анализе разных образцов. Этоможет существенно снизить требования, предъявляемые к системе дозирования реагентов истандартизации условий анализа в полевых условиях.Рисунок 11. Зависимость сигналов от объемов образцов, пропущенных через фильтр за 15 мин сразличными скоростями при детектировании 1 нг/мл СЭА и ТСТШ в цельном молокеПятая глава посвящена разработке иммунохроматографического экспресс-анализадля детекции онкомаркера – простатического специфического антигена – в сыворотке кровичеловека с использованием магнитных наномаркеров, детектируемых с помощью метода,описанного в четвертой главе.Схема взаимодействий иммунореагентов и антител на магнитных частицах, а такжефотографии ИХА тест-полосок, детектирующих ПСА с использованием МЧ представленына рис. 12.

Видно, что при увеличении концентрации ПСА интенсивность тестовой линииувеличивается, а контрольной – несколько уменьшается. Снижение интенсивностиконтрольной линии объясняется тем, что при больших концентрациях значительная частьчастиц остается на тестовой линии.19А)Б)Рисунок 12. Иммунохроматографические тест-полоски с использованием магнитныхнаномаркеров: А) – cхема тест-полоски до (слева) и после (справа) проведения анализа; АГ –детектируемый антиген, содержащийся в анализируемой пробе; МЧ – магнитные частицы,конъюгированные с детектирующими антителами; АТТ – тестовая линия, содержащая антитела кдругому эпитопу антигена; АТК – контрольная линия, содержащая антитела, специфическираспознающие антитела на магнитных частицах; ТЛ и КЛ – тестовая и контрольная линии,образованные в результате анализа; Б) – фотография ИХА тест-полосок при определении ПСА вразличных концентрациях.Спомощьюсканирующейэлектронноймикроскопии(СЭМ)полученымикрофотографии иммунохроматографических мембран до и после анализа (рис.