Разработка методов иммуноанализа с использованием магнитных наномаркеров

На правах рукописиОрлов Алексей ВладимировичРАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ИММУНОАНАЛИЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕММАГНИТНЫХ НАНОМАРКЕРОВСпециальность 03.01.02 – «Биофизика», 03.01.08 – «Биоинженерия»АВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата физико-математических наукМосква 2014РаботавыполненавЛабораторииБиофотоникиФедеральногогосударственного бюджетного учреждения науки Института общей физики им.А.М. Прохорова Российской академии наук (ИОФ РАН).Научныйруководитель:Никитин Петр Иванович, к.ф.-м.н., заведующийлабораториейБиофотоникиФедеральногогосударственногобюджетногоучреждениянаукиИнститута общей физики им. А.М. Прохорова Российскойакадемии наукОфициальныеоппоненты:ПантелеевМихаилАлександрович,д.

ф.-м. н.,заведующий лабораторией Молекулярных механизмовгемостаза, Федеральное государственное бюджетноеучреждение науки Центр теоретических проблем физикохимической фармакологии Российской академии наукЕремин Сергей Александрович, д. х. н., руководительгруппы иммунохимических методов анализа, химическийфакультет Федерального государственного бюджетногообразовательногоучреждениявысшегопрофессиональногообразованияМосковскийгосударственный университет имени М.В.

ЛомоносоваВедущаяорганизация:Федеральное государственное бюджетное учреждениенауки Институт биоорганической химии им. академиковМ.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российскойакадемии наукЗащита диссертации состоится 10 апреля 2014 г. в __ часов на заседаниидиссертационного совета Д501.002.11 в Федеральном государственномбюджетном образовательном учреждении высшего профессиональногообразованияМосковскомгосударственномуниверситетеимениМ.В. Ломоносова, физический факультет.С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московскогогосударственного университета имени М.В. Ломоносова.Автореферат разослан «__» _________ 2014 г.Ученый секретарьдиссертационного совета,кандидат технических наукСидороваА.Э.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность проблемыВ последние годы значительное внимание исследователей во всем мире уделяетсяразработке биофизических методов для высокочувствительной количественной регистрациибиомолекул и их взаимодействий между собой.

В частности, высокая востребованность состороны таких отраслей, как фармацевтическая промышленность, медицинская диагностика,экологический мониторинг и др., диктует необходимость разработки точных и скоростныхметодов обнаружения белковых молекул в биологических образцах сложного состава (кровь,сыворотка, слюна, молоко и т.д.). Исследования в данном направлении требуютмеждисциплинарного подхода и чрезвычайно важны, поскольку их результаты могутиспользоваться для решения широкого круга научных и прикладных задач.Однимиммуноанализ.изнаиболееТрадиционныепопулярныхметодовколичественныедетекцииметодыбиомолекулиммуноанализа,являетсятакиекакиммуноферментный анализ, характеризуются длительным временем получения результата(не менее 2 ч). Относительно быстрые методы, позволяющие получить результат в течение10 мин, например иммунохроматографический анализ, как правило, дают толькокачественную оценку в терминах "да/нет".Перспективным подходом для увеличения чувствительности и сокращения временииммуноанализаявляетсяиспользованиемагнитныхнаночастиц(МЧ)вкачестведетектируемых меток.

Одним из преимуществ таких меток является возможность ихиспользования в непрозрачных или сильно рассеивающих средах, например, в сочетании стрехмернымитвердымифазами,гдеприменениетрадиционныхокрашенных,флуоресцентных и ферментных маркеров сильно ограничено.Выбор метода детекции применяемых меток – один из факторов, оказывающихсущественное влияние на эффективность иммуноанализа. Методы регистрации МЧ наоснове гигантского магнитного сопротивления (ГМС), как правило, характеризуютсяневысоким соотношением сигнал/шум, требуют съемных электрических контактов сосчитывающим устройством и весьма затратны для однократных применений.

Кроме того,ГМС-детекторы преимущественно используются в сочетании с магнитными кластерами,соизмеримыми по размеру с чувствительным элементом сенсора, что приводит к слабойзависимости сигналов от концентрации аналита и высокому неспецифическому связыванию.Одна из наиболее чувствительных методик регистрации МЧ, основанная на использованиикриогенных сверхпроводящих квантовых интерференционных магнетометров, являетсядостаточно дорогостоящей и труднодоступной для рутинного использования в медицинскойдиагностике и экологическом мониторинге.

Таким образом, разработка методов анализа,3использующих магнитные частицы в качестве меток в сочетании с методами регистрациитаких меток, обеспечивающими высокую чувствительность, доступность и высокоеотношение сигнал/шум, является перспективным направлением в разработке новыхподходов в биосенсорике и иммуноанализе.Одним из этапов разработки иммуноанализа является оптимизация его условий:выбор антител, способа их иммобилизации, времени инкубации и концентрациииммунореагентов, а также состава буферных и стабилизирующих растворов. Влияниекаждого из этих параметров можно оценить с помощью методов, использующих различныеметки, лишь на завершающей стадии иммуноанализа.

Безметочные оптические методы могутзначительно повысить эффективность разработки протокола иммуноанализа за счетколичественного мониторинга в режиме реального времени взаимодействий междубиомолекулами на каждой стадии анализа, а также сокращения времени и числа операций.Таким образом, развитие безметочных методик для изучения в реальном временимежмолекулярных взаимодействий также является актуальной задачей.Цели и задачи работыЦель работы состояла в разработке биофизических методов, основанных наиспользованиимагнитныхнаночастицвкачестведетектируемыхметок,длявысокочувствительной количественной регистрации биомолекул и их взаимодействий междусобой.

Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи: Разработка и верификация методики количественной оценки взаимодействия биомолекулмежду собой и с магнитными наночастицами путем мониторинга в режиме реальноговременикаждогоэтапаиммуноанализаспомощьюспектрально-корреляционнойинтерферометрии. Изучениеспомощьюметодаспектрально-корреляционнойинтерферометрииконформационных изменений при смене состава водного окружения слоя сополимеров N,Nдиметилакриламида и N-акрилоил-m-аминофенилборной кислоты, иммобилизованных настеклянной поверхности. Изучение влияния магнитных наночастиц на предел детекции метода спектральнокорреляционой интерферометрии при их использовании для амплификации сигнала посравнению с безметочной регистрацией. Разработка метода детекции биомолекул, основанного на использовании объемныхволоконных фильтров в качестве твердой фазы иммуноанализа и магнитных наномаркеров. Разработкаметодадетекциибиомолекул,основанногонапринципеиммунохроматографии с использованием МЧ в качестве меток в сочетании с методомрегистрации нелинейных магнитных материалов на комбинаторных частотах.4Научная новизна и практическая значимостьРазработан метод регистрации биомолекул, обладающий оригинальным сочетаниеманалитических характеристик: а) широким линейным диапазоном, составляющим более 3порядков концентрации аналита; б) малой продолжительностью анализа; в) возможностьюанализировать образцы практически любого объема, причем чувствительность метода растетпри увеличении объема образца; г) отсутствием пробоподготовки для биологическихобразцов сложного состава, например, цельного молока.

Данные свойства методапродемонстрированынапримередетекциитоксинов,продуцируемыхбактериямиЗолотистого стафилококка. Новизна метода заключается в применении объемныхволоконных фильтров в качестве твердой фазы анализа в сочетании с использованиеммагнитных наномаркеров, регистрируемых со всего объема фильтров методом детекциинелинейных магнетиков на комбинаторных частотах.

Применение фильтров обеспечиваетбольшую реакционную поверхность твердой фазы – 20 см2 в объеме около 35 мкл, а такжеэффективное взаимодействие и быстрое концентрирование антигена на твердой фазе симмобилизованными антителами непосредственно в ходе анализа. Применяемый подход длярегистрации МЧ характеризуется высоким отношением сигнал/шум, поскольку окружающиедиа- и парамагнитные материалы, такие как компоненты крови, стекло, вода, пластик и т.д.,не вносят вклад в детектируемый сигнал.Разработанколичественныйметодиммунохроматографическогоанализасиспользованием магнитных наномаркеров для регистрации в сыворотке крови человекаонкомаркера – простатического специфического антигена (ПСА). Данный метод совмещаетпреимущества лабораторных методов и экспресс-тестов на основе сухой химии: он обладаетвысокой чувствительностью и позволяет получать количественные результаты при простотеиспользования и коротком времени получения результата.Оба разработанных метода иммуноанализа могут найти практическое применение вобласти диагностики заболеваний и биобезопасности как в лабораторных, так и домашнихусловиях, а также для контроля пищевой продукции, экологическом мониторинге, вветеринарии и т.д.Разработана методика для количественного изучения взаимодействия биомолекул сцелью мониторинга каждой стадии иммуноанализа.

Методика основана на принципеспектрально-корреляционной интерферометрии с использованием в качестве сенсорныхчипов стандартных микроскопных покровных стекол. Методика успешно испытана напримереизучениявлиянияпептидногофрагмента(65–76)C-концевогодоменамоноцитарного хемотаксического белка-1 (MCP-1) на взаимодействие MCP-1 с гепарином, атакже для изучения обратимых конформационных изменений полимерных структур на5поверхности стекла. Полученные результаты подтверждены независимыми методами:вискозиметрией,эллипсометрией,иммуноферментныманализом.сканирующейПродемонстрированаэлектронноймикроскопией,возможностьколичественногомониторинга каждого этапа иммуноанализа с использованием магнитных наночастиц вкачестве меток.

Оригинальность разработанного подхода заключается в возможностирегистрации в реальном времени взаимодействия между биомолекулами непосредственно настеклянной поверхности без нанесения дополнительных проводящих или диэлектрическихпленок. Разработанная методика может найти применение как для развития новых методовиммуноанализа, так и для широкого круга приложений, требующих количественной оценкидинамики межмолекулярных взаимодействий.На примере детекции кардиомаркера сердечного тропонина I (сТнI) показано, чтоприменение магнитных наночастиц в качестве меток приводит к усилению сигналаспектрально-корреляционнойинтерферометрии,причемиспользованиемагнитныхнаномаркеров приводит к увеличению чувствительности по сравнению с безметочнойрегистрацией примерно в 100 раз.