Исследование структурных свойств полимеров амилоид beta пептида и лизоцима методами силовой спектроскопии и атомно-силовой микроскопии, страница 3

8 A.  íåêîòîðûõ ó÷àñòêàõ ïîâåðõíîñòè òàêæå áûëè îáíàðóæåíû ëèíåéíûå ôèáðèëëû.À íà îáðàçöå, íàõîäÿùåìñÿ â áóôåðíîì ðàñòâîðå â òå÷åíèå 22äíåé ïðè òåìïåðàòóðå 50 ◦ Ñ, áûëè îáíàðóæåíû òîëüêî ëèíåéíûåôèáðèëëû, ñì. ðèñ. 8 Á. Èç ýòèõ ðåçóëüòàòîâ ìîæíî ñäåëàòü âûâîä,÷òî, âîçìîæíî, â íåêîòîðûõ ñëó÷àÿõ ïîðîîáðàçîâàíèå ïðåäøåñòâóåòîáðàçîâàíèþ ôèáðèëë. Àíàëîãè÷íûå ïðåäïîëîæåíèÿ áûëè ñäåëàíû15Ðèñ. 7.

Èçîáðàæåíèÿ ïîâåðõíîñòè çîëîòà ñî ñëîåì ëèçîöèìà. Îíèäåìîíñòðèðóþò èçìåíåíèå ôîðìû àãðåãàòîâ ëèçîöèìà, õèìè÷åñêèñîðáèðîâàííîãî íà ïîâåðõíîñòü çîëîòà, â òå÷åíèå 1 ìèí (A), 4.5 (Á)è 19 ÷ (Â). (Ã) Èçîáðàæåíèå ôèáðèëë ëèçîöèìà íà ïîâåðõíîñòè ãðàôèòà, îáðàçîâàâøèåñÿ â òå÷åíèå 7 äíåé âñëåäñòâèå ôèçè÷åñêîé àäñîðáöèè áåëêà íà ïîâåðõíîñòü.â ðàáîòå [7].Ðåçóëüòàòû ýòèõ ýêñïåðèìåíòîâ ãîâîðÿò î òîì, ÷òî áëèçîñòü ïîâåðõíîñòè ïðèâîäèò ê ïîíèæåíèþ òåìïåðàòóðû êîíôîðìàöèîííîãîïåðåõîäà, íî íå äî êîìíàòíîé, êàê â ñëó÷àå ãðàôèòà, à äî òåìïåðàòóðû â äèàïàçîíå 20 50 ◦ Ñ.16Ðèñ.

8. (À) Èçîáðàæåíèå ïîâåðõíîñòè ñëþäû ñî ñëîåì ëèçîöèìà, ôèçè÷åñêè ñîðáèðîâàííîãî íà ïîâåðõíîñòü â òå÷åíèå 11 äíåé ïðè òåìïåðàòóðå 50 ◦ Ñ. (Á) Èçîáðàæåíèå ïîâåðõíîñòè ñëþäû ñî ñëîåì ëèçîöèìà, ôèçè÷åñêè ñîðáèðîâàííîãî íà ïîâåðõíîñòü â òå÷åíèå 22 äíåéïðè òåìïåðàòóðå 50 ◦ Ñ.Íà îáðàçöàõ ñëþäû ñî ñëîåì 3-àìèíîïðîïèëñèëàòðàíà, íàõîäÿùèõñÿ â áóôåðíîì ðàñòâîðå â òå÷åíèå 11 è 22 äíåé ïðè òåìïåðàòóðå50 ◦ Ñ, áûëè îáíàðóæåíû òîëüêî ëèíåéíûå ôèáðèëëû, ñì. ðèñ. 9 Á.Ýòî òàêæå ñâèäåòåëüñòâóåò î ïîíèæåíèè òåìïåðàòóðû êîíôîðìàöèîííîãî ïåðåõîäà äî 20 50 ◦ Ñ, ïîòîìó ÷òî òàêèõ ôèáðèëë íå áûëîíà îáðàçöå, íàõîäÿùåìñÿ â áóôåðíîì ðàñòâîðå â òå÷åíèå 7 äíåé ïðèòåìïåðàòóðå 20 ◦ Ñ, ñì. ðèñ. 9 À.Íà îáðàçöàõ çîëîòà íàõîäÿùèõñÿ â áóôåðíîì ðàñòâîðå â òå÷åíèå11 è 22 äíåé ïðè òåìïåðàòóðå 50 ◦ Ñ íå áûëî îáíàðóæåíî íèêàêèõàãðåãàòîâ (êàê è íà îáðàçöå, íàõîäÿùåìñÿ â áóôåðíîì ðàñòâîðå âòå÷åíèå 7 äíåé ïðè òåìïåðàòóðå 20 ◦ Ñ), ñì.

ðèñ. 10. Ýòè ðåçóëüòàòûãîâîðÿò î òîì, ÷òî ïðè ñîðáöèè ëèçîöèìà íà çîëîòî íå ïðîèñõîäèòçíà÷èòåëüíîãî ïîíèæåíèÿ òåìïåðàòóðû êîíôîðìàöèîííîãî ïåðåõîäà.Êîíòðîëüíûå ýêñïåðèìåíòû ïîêàçûâàþò, ÷òî çà 22 äíÿ â áóôåð17Ðèñ. 9.(À) Èçîáðàæåíèå ïîâåðõíîñòè ñëþäû ñî ñëîåì 3àìèíîïðîïèëñèëàòðàíà è ñëîåì ëèçîöèìà, ôèçè÷åñêè ñîðáèðîâàííîãî íà ïîâåðõíîñòü â òå÷åíèå 7 äíåé ïðè òåìïåðàòóðå 20 ◦ Ñ. (Á)Èçîáðàæåíèå ïîâåðõíîñòè ñëþäû ñî ñëîåì 3-àìèíîïðîïèëñèëàòðàíàè ñëîåì ëèçîöèìà, ôèçè÷åñêè ñîðáèðîâàííîãî íà ïîâåðõíîñòü â òå÷åíèå 22 äíåé ïðè òåìïåðàòóðå 50 ◦ Ñ.Ðèñ.

10. (À) Èçîáðàæåíèå ïîâåðõíîñòè çîëîòà ñî ñëîåì ëèçîöèìà,ôèçè÷åñêè ñîðáèðîâàííîãî íà ïîâåðõíîñòü â òå÷åíèå 7 äíåé ïðè òåìïåðàòóðå 20 ◦ Ñ. (Á) Èçîáðàæåíèå ïîâåðõíîñòè çîëîòà ñî ñëîåì ëèçîöèìà, ôèçè÷åñêè ñîðáèðîâàííîãî íà ïîâåðõíîñòü â òå÷åíèå 11 äíåéïðè òåìïåðàòóðå 50 ◦ Ñ.18Òàáëèöà 1.

Òåìïåðàòóðû êîíôîðìàöèîííîãî ïåðåõîäà â ëèçîöèìåïðè áóôåðíîãî ðàñòâîðà ðÍ3 íà ðàçëè÷íûõ ïîâåðõíîñòÿõ.  ðàñòâîðå äàæå ïðè áîëåå íèçêîì ðÍ2 (åùå áîëåå ñïîñîáñòâóþùåì êîíôîðìàöèîííîìó ïåðåõîäó) êîíôîðìàöèîííûé ïåðåõîä ïðîèñõîäèò òîëüêî ïðè 57 ◦ Ñ [5].íîì ðàñòâîðå ôèáðèëë èëè ïîð íå ïîÿâëÿåòñÿ, ò.å. âñå àãðåãàãàòû ýòî ñëåäñòâèå êîìïëåêñîîáðàçîâàíèÿ íà ïîâåðõíîñòè.Òàêèì îáðàçîì áûëî èññëåäîâàíà àãðåãàöèÿ ëèçîöèìà íà ïîâåðõíîñòÿõ ãðàôèòà, ñëþäû, ñëþäû ñî ñëîåì 3-àìèíîïðîïèëñèëàòðàíà èçîëîòà ïðè òåìïåðàòóðàõ 20 ◦ Ñ è 50 ◦ Ñ, è ïðè ôèçè÷åñêîì è õèìè÷åñêîì òèïå ñîðáöèè.

Ýòè äàííûå ñâåäåíû â òàáëèöó 1.Êðîìå ýòîãî ïðè ïîìîùè íîâîãî ìåòîäà èññëåäîâàíèÿ ìåæìîëåêóëÿðíîãî âçàèìîäåéñòâèÿ íà Àòîìíûõ âåñàõ [9] áûëà îïðåäåëåíà ñèëà âçàèìîäåéñòâèÿ äâóõ ìîëåêóë ëèçîöèìà, íàõîäÿùèõñÿ â ñîñòîÿíèè ñ íåïðàâèëüíîé óêëàäêîé, êîòîðàÿ îêàçàëàñü ðàâíîé 113 ± 24 ïÍ. Ýòîò ìåòîä çàêëþ÷àåòñÿ â èçìåðåíèè èçãèáà êàíòèëåâåðà, íà îäíó èç ñòîðîí êîòîðîãî íàíåñåí ëèçîöèì, ñì.

ðèñ. 11. ýòîé ðàáîòå ïðè ïîìîùè àòîìíî-ñèëîâîãî ìèêðîñêîïà19Ðèñ. 11. Âðåìåííàÿ çàâèñèìîñòü ïîâåðõíîñòíîãî íàòÿæåíèÿ ïëåíêèëèçîöèìà, íàõîäÿùåéñÿ íà çîëîòîé (1) è êðåìíèåâîé (2) ïîâåðõíîñòè êàíòèëåâåðà; 3, 4 - ðåçóëüòàòû ñîîòâåòñòâóþùèõ êîíòðîëüíûõýêñïåðèìåíòîâ, â êîòîðûõ êàíòèëåâåð íå îáðàáàòûâàëè ëèçîöèìîì.ÔåìòîÑêàí èññëåäîâàíî ôîðìèðîâàíèå ôèáðèëë ëèçîöèìà íà òâåðäîé ïîäëîæêå.

Îáíàðóæåíî, ÷òî ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå è pH3 áóôåðíîãî ðàñòâîðà, ò.å. â óñëîâèÿõ, ïðè êîòîðûõ àãðåãàöèÿ âðàñòâîðå íå ïðîèñõîäèò, íà ïîâåðõíîñòè ìîæåò íàáëþäàòüñÿ îáðàçîâàíèå ôèáðèëë. Óñòàíîâëåíî, ÷òî áëèçîñòü ìîëåêóë ëèçîöèìà êïîâåðõíîñòè ãðàôèòà ñïîñîáñòâóåò èõ àãðåãàöèè. Îáíàðóæåíî, ÷òîôèçè÷åñêàÿ ñîðáöèÿ ëèçîöèìà íà ïîâåðõíîñòü çîëîòà íå ïðèâîäèò êåãî àãðåãàöèè, à õèìè÷åñêàÿ ñîðáöèÿ ëèçîöèìà ê ïîâåðõíîñòè çîëîòà ñïîñîáñòâóåò îáðàçîâàíèþ ôèáðèëë. Íà Àòîìíûõ âåñàõ èçìåðåíàñèëà âçàèìîäåéñòâèÿ ìîëåêóë ëèçîöèìà. ãëàâå 3 îïèñàíû ïîëó÷åííûå ðåçóëüòàòû è ïðîâåäåí àíàëèçýòèõ ðåçóëüòàòîâ.203Îñíîâíûå ðåçóëüòàòû è âûâîäû1.

Îáíàðóæåíî, ÷òî èçìåíåíèå ñòðóêòóðíûõ ñâîéñòâ àìèëîèä βïåïòèäà è ëèçîöèìà (êîíôîðìàöèîííûé ïåðåõîä ìîëåêóë èç íàòèâíîãî ñîñòîÿíèÿ â ñîñòîÿíèå ñ íåïðàâèëüíîé óêëàäêîé) ïðîèñõîäèò èç-çà èçìåíåíèÿ òåìïåðàòóðû, pH, âèäà ïîâåðõíîñòèè òèïà ñîðáöèè è ïðèâîäèò ê èçìåíåíèþ ìåæìîëåêóëÿðíîãîâçàèìîäåéñòâèÿ è ê îáðàçîâàíèþ ôèáðèëë è äðóãèõ òèïîâ àãðåãàòîâ.2. Îïðåäåëåíû óñëîâèÿ (ïîâûøåíèå êèñëîòíîñòè ñðåäû ñ ðÍ6 äîðÍ3, ïîâûøåíèå òåìïåðàòóðû ñ 20 ◦ Ñ äî 50 ◦ Ñ, áëèçîñòü ïîâåðõíîñòè è òèï ñîðáöèè), ïðè êîòîðûõ àìèëîèä β ïåïòèä èëèçîöèì ïåðåõîäÿò èç íàòèâíîé êîíôîðìàöèè â ñîñòîÿíèå ñíåïðàâèëüíîé óêëàäêîé.3.

Âñëåäñòâèè êîíôîðìàöèîííîãî ïåðåõîäà èç íàòèâíîé êîíôîðìàöèè â ñîñòîÿíèå ñ íåïðàâèëüíîé óêëàäêîé ïðîèñõîäèò ðåçêîåóâåëè÷åíèå âåðîÿòíîñòè âçàèìîäåéñòâèÿ äâóõ ìîëåêóë ìåæäóñîáîé ïî ñðàâíåíèþ ñ íàòèâíîé êîíôîðìàöèåé, â êîòîðîé ìîëåêóëû ïî÷òè íå âçàèìîäåéñòâóþò ìåæäó ñîáîé, íàïðèìåð, ñèëà âçàèìîäåéñòâèÿ äâóõ ìîëåêóë â ñîñòîÿíèè ñ íåïðàâèëüíîéóêëàäêîé ðàâíà F ∼ 40 ïÍ äëÿ àìèëîèä β ïåïòèäà è F ∼ 110 ïÍäëÿ ëèçîöèìà.4.  ýêñïåðèìåíòàõ íàáëþäàëîñü ôîðìèðîâàíèå ôèáðèëë è ïîðîîáðàçíûõ àãðåãàòîâ ëèçîöèìà íà òâåðäîé ïîäëîæêå â óñëîâèÿõ,ïðè êîòîðûõ îíè íå îáðàçóþòñÿ â ðàñòâîðå.

Àãðåãàöèÿ ëèçîöèìà ñâÿçàíà ñ ðàçëè÷èåì â ìåæìîëåêóëÿðíîì âçàèìîäåéñòâèèìîëåêóë, íàõîäÿùèõñÿ íà ïîâåðõíîñòè (â ñîñòîÿíèè ñ íåïðàâèëüíîé óêëàäêîé) è â ðàñòâîðå (â íàòèâíîé êîíôîðìàöèè) ïðèîäèíàêîâûõ ïàðàìåòðàõ ñðåäû (ðÍ3, 20 ◦ Ñ).215. Îáíàðóæåíî, ÷òî õèìè÷åñêàÿ ñîðáöèÿ ìîëåêóë ëèçîöèìà ê ïîâåðõíîñòè çîëîòà è ôèçè÷åñêàÿ ñîðáöèÿ ìîëåêóë ëèçîöèìà íàïîâåðõíîñòü ãðàôèòà ïðèâîäèò ê ïîíèæåíèþ òåìïåðàòóðû êîíôîðìàöèîííîãî ïåðåõîäà èç íàòèâíîãî ñîñòîÿíèÿ â ñîñòîÿíèå ñíåïðàâèëüíîé óêëàäêîé ïî êðàéíåé ìåðå äî êîìíàòíîé òåìïåðàòóðû.6. Îáíàðóæåíî, ÷òî ôèçè÷åñêàÿ ñîðáöèÿ ìîëåêóë ëèçîöèìà íà ïîâåðõíîñòü ñëþäû è ñëþäû ñî ñëîåì 3-àìèíîïðîïèëñèëàòðàíàïðèâîäèò ê ïîíèæåíèþ òåìïåðàòóðû êîíôîðìàöèîííîãî ïåðåõîäà èç íàòèâíîãî ñîñòîÿíèÿ â ñîñòîÿíèå ñ íåïðàâèëüíîé óêëàäêîé ïî êðàéíåé ìåðå äî 50 ◦ Ñ.4Öèòèðóåìàÿ ëèòåðàòóðà1.

C. Ray, J.R. Brown, B.B. Akhremitchev, Single-molecule Force SpectroscopyMeasurements of "Hydrophobic Bond"between Tethered HexadecaneMolecules // 2006, 110(35), pp.17578-17583.2. A. Rubinstein, L. Kinarsky, Y. Lyubchenko and S. Sherman, High TemperatureMolecular Dynamics Simulations of the Amyloid β (1-40) Peptide //April 20, 2005, p.20.3. C. McAllister, M. Karymov, Y. Kawano, A.Y.

Lushnikov, A. Mikheikin, V.N.Uversky and Y.L. Lyubchenko, Protein Interactions and Misfolding Analyzedby AFM Force Spectroscopy //, 2005, v.354, N.5, pp.1028 1043.4. W.B. Stine, Jr., K.N. Dahlgren, G.A. Krat, and M.Jo LaDu, In VitroCharacterization of Conditions for Amyloid-β Peptide Oligomerization andFibrillogenesis //, 2003, v.278, N.13, pp.11612 11622.5. L.N. Arnaudov, Renko de Vries, Thermally Induced Fibrillar Aggregation ofHen Egg White Lysozyme //, 2005, v.88, p.515-526.J. Phys. Chem. BThe FirstAnnual Nebraska EPSCoR Research ExpoJournal of Molecular BiologyThe journal of biological chemistryBiophys J.226. C. Czeslik and R. Winter, Eect of temperature on the conformation oflysozyme adsorbed to silica particles, //, 2001, v.3, pp.235-239.7.

M. Stefani, Protein misfolding and aggregation: new examples in medicine andbiology of the dark side of the protein world //, 2004, v.1739, pp.5-25.8. Ôèëîíîâ À.Ñ., Ãàâðèëêî Ä.Þ., ßìèíñêèé È.Â. Ïðîãðàììíîå îáåñïå÷åíèå äëÿ îáðàáîòêè òðåõìåðíûõ èçîáðàæåíèé "ÔåìòîÑêàí Îíëàéí". Ì.:Öåíòð ïåðñïåêòèâíûõ òåõíîëîãèé, 2005. 89 ñ.

(http://www.nanoscopy.net).Filonov A.S., Gavrilko D.Yu., Yaminsky I.V., FemtoScan Online SPM ImageProcessing Software Manual, Moscow, Advanced Technologies Center, 2005 89 p. (http://www.nanoscopy.net).9. Êèñåëåâ Ã.À., Áàãðîâ Ä.Â., Ãîðåëêèí Ï.Â., ßìèíñêèé È.Â. Ñåíñîð íà îñíîâå àòîìíî-ñèëîâîãî ìèêðîñêîïà //, 2005, N.4, c.22.Phys. Chem. Chem. Phys.Biochimica et Biophysica ActaÑåíñîð5Ïóáëèêàöèè1.