Исследование структурных свойств полимеров амилоид beta пептида и лизоцима методами силовой спектроскопии и атомно-силовой микроскопии

Íà ïðàâàõ ðóêîïèñèÓêðàèíöåâ Åãîð Âëàäèñëàâîâè÷Èññëåäîâàíèå ñòðóêòóðíûõ ñâîéñòâïîëèìåðîâ àìèëîèä β ïåïòèäà èëèçîöèìà ìåòîäàìè ñèëîâîéñïåêòðîñêîïèè è àòîìíî-ñèëîâîéìèêðîñêîïèèÑïåöèàëüíîñòü 02.00.06 - Âûñîêîìîëåêóëÿðíûå ñîåäèíåíèÿÀÂÒÎÐÅÔÅÐÀÒäèññåðòàöèè íà ñîèñêàíèå ó÷åíîé ñòåïåíèêàíäèäàòà ôèçèêî-ìàòåìàòè÷åñêèõ íàóêÌîñêâà 2007Ðàáîòà âûïîëíåíà íà êàôåäðå ôèçèêè ïîëèìåðîâ è êðèñòàëëîâôèçè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà Ìîñêîâñêîãî Ãîñóäàðñòâåííîãî Óíèâåðñèòåòà èìåíè Ì.Â.Ëîìîíîñîâà.Íàó÷íûé ðóêîâîäèòåëü:Äîêòîð ôèçèêî-ìàòåìàòè÷åñêèõíàóê, ïðîôåññîðßìèíñêèé ÈãîðüÂëàäèìèðîâè÷Îôèöèàëüíûå îïïîíåíòû:Äîêòîð ôèçèêî-ìàòåìàòè÷åñêèõíàóê, ïðîôåññîðÊàíäèäàò ôèçèêîìàòåìàòè÷åñêèõ íàóêØàéòàí ÊîíñòàíòèíÂîëüäåìàðîâè÷Äþæåâ ÍèêîëàéÀëåêñååâè÷Âåäóùàÿ îðãàíèçàöèÿ:Èíñòèòóò áèîîðãàíè÷åñêîé õèìèè èì. àêàäåìèêîâ Ì.Ì.

Øåìÿêèíà è Þ.À. Îâ÷èííèêîâà Ðîññèéñêîé àêàäåìèè íàóêÇàùèòà ñîñòîèòñÿ 16 ìàÿ 2007 ã. â 15 ÷àñ. íà çàñåäàíèè äèññåðòàöèîííîãî ñîâåòà Ä 501.002.01 â Ìîñêîâñêîì Ãîñóäàðñòâåííîì Óíèâåðñèòåòå èìåíè Ì.Â.Ëîìîíîñîâà ïî àäðåñó: 119992, ÃÑÏ-2, Ìîñêâà,Ëåíèíñêèå ãîðû, Ôèçè÷åñêèé ôàêóëüòåò ÌÃÓ, ä.1, ñòðîåíèå 35,Êîíôåðåíö-çàë ÖÊÏ ôèçè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà.Ñ äèññåðòàöèåé ìîæíî îçíàêîìèòüñÿ â áèáëèîòåêå ôèçè÷åñêîãîôàêóëüòåòà ÌÃÓ.Àâòîðåôåðàò ðàçîñëàí 11 àïðåëÿ 2007 ã.Ó÷åíûé ñåêðåòàðüäèññåðòàöèîííîãî ñîâåòàÄ 501.002.01êàíäèäàò ôèçèêî-ìàòåìàòè÷åñêèõíàóêÒ.Â. Ëàïòèíñêàÿ1 Îáùàÿ õàðàêòåðèñòèêà ðàáîòûÀêòóàëüíîñòü òåìûÎäíà èç àêòóàëüíûõ íà ñåãîäíÿøíèé äåíü ïðîáëåì, ñòîÿùàÿ ïåðåä ôèçèêàìè, çàêëþ÷àåòñÿ â òîì, ÷òî íóæíî èçó÷èòü âëèÿíèå òåìïåðàòóðû, ðÍ, òèïà ïîâåðõíîñòè è âèäà ñîðáöèè íà êîíôîðìàöèþìîëåêóë ïîëèìåðîâ, à òàêæå ìåõàíèçì âçàèìîäåéñòâèÿ ìîëåêóë, íàõîäÿùèõñÿ â íàòèâíîì ñîñòîÿíèè èëè â êîíôîðìàöèè ñ íåïðàâèëüíîé óêëàäêîé.

Èçâåñòíî, ÷òî áîëüøå ïîëîâèíû íåéðîäåãåíåðàòèâíûõçàáîëåâàíèé ñâÿçàíî ñ íåïðàâèëüíûì ñêëàäûâàíèåì áåëêîâûõ ìîëåêóë. Ïîýòîìó î÷åíü âàæíî èçó÷èòü âëèÿíèå òåìïåðàòóðû, ðÍ, òèïàïîâåðõíîñòè è âèäà ñîðáöèè íà êîíôîðìàöèþ ìîëåêóë ïîëèìåðîâ.Ôèçè÷åñêàÿ è õèìè÷åñêàÿ ñîðáöèÿ ìîëåêóë ê ïîâåðõíîñòè ÿâëÿåòñÿ âàæíûì ôàêòîðîì, îïðåäåëÿþùèì êîíôîðìàöèþ ìîëåêóë. Ïîýòîìó íóæíî èññëåäîâàòü, êàê áóäóò ìåíÿòüñÿ ñâîéñòâà ìàêðîìîëåêóëÿðíîãî ïîëèìåðíîãî êîìïëåêñà ïðè åãî çàêðåïëåíèè íà ïîâåðõíîñòè.

Èçìåíåíèå ñâîéñòâ ïîëèìåðîâ ïðè ôèçè÷åñêîé è õèìè÷åñêîéñîðáöèè ïîêà åùå íå äîñòàòî÷íî èçó÷åíî. Áîëüøèíñòâî ïðîöåññîâ âîðãàíèçìå ÷åëîâåêà ïðîèñõîäÿò íà ðàçëè÷íûõ ïîâåðõíîñòÿõ, íàïðèìåð ìåìáðàíàõ êëåòîê, ïîýòîìó î÷åíü âàæíî çíàòü, êàê ðàçëè÷àþòñÿñâîéñòâà ìîëåêóë â îáúåìå è íà ïîâåðõíîñòè.Öåëè ðàáîòû1. Èçó÷èòü ïðè÷èíû (èçìåíåíèå òåìïåðàòóðû, pH, âèäà ïîâåðõíîñòè è òèïà ñîðáöèè) è ñëåäñòâèÿ (âîçíèêíîâåíèå ñèëüíîãîìåæìîëåêóëÿðíîãî âçàèìîäåéñòâèÿ ìåæäó îäèíàêîâûìè ìîëåêóëàìè, îáðàçîâàíèå ôèáðèëë è äðóãèõ òèïîâ àãðåãàòîâ) êîíôîðìàöèîííîãî ïåðåõîäà ìîëåêóë áèîïîëèìåðîâ èç íàòèâíîãîñîñòîÿíèÿ â ñîñòîÿíèå ñ íåïðàâèëüíîé óêëàäêîé.12.

Èçó÷èòü êîíôîðìàöèîííûå ïåðåõîäû â áèîìàêðîìîëåêóëàõ ñïîìîùüþ àòîìíî-ñèëîâîé ìèêðîñêîïèè è ñèëîâîé ñïåêòðîñêîïèè.3. Íà àòîìíî-ñèëîâîì ìèêðîñêîïå è íà Àòîìíûõ âåñàõ èçó÷èòüìåæìîëåêóëÿðíîå âçàèìîäåéñòâèå ïîëèìåðîâ, íàõîäÿùèõñÿ âíàòèâíîì ñîñòîÿíèè è ñîñòîÿíèè ñ íåïðàâèëüíîé óêëàäêîé íàïðèìåðå àìèëîèä β ïåïòèäà è ëèçîöèìà.4. Îïðåäåëèòü ôàêòîðû (òåìïåðàòóðà, pH, âèä ïîâåðõíîñòè è òèïñîðáöèè), êîòîðûå âëèÿþò íà êîíôîðìàöèþ ìîëåêóë.5. Èçó÷èòü ïîñëåäñòâèÿ èçìåíåíèÿ ìîëåêóëàìè êîíôîðìàöèè íàâçàèìîäåéñòâèå ìîëåêóë ìåæäó ñîáîé íà ïðèìåðå àìèëîèä βïåïòèäà è ëèçîöèìà.6. Èññëåäîâàòü àãðåãàöèþ ìîëåêóë ëèçîöèìà íà ðàçëè÷íûõ ïîâåðõíîñòÿõ (ñëþäà, çîëîòî, ãðàôèò) è ïðè ðàçëè÷íûõ òèïàõñîðáöèè (ôèçè÷åñêàÿ èëè õèìè÷åñêàÿ).7.

Èññëåäîâàòü âëèÿíèå âèäà ïîâåðõíîñòè è òèïà ñîðáöèè íà òåìïåðàòóðó êîíôîðìàöèîííîãî ïåðåõîäà â ëèçîöèìå.Íàó÷íàÿ íîâèçíà ðàáîòû1. Ìåòîäàìè ñèëîâîé ñïåêòðîñêîïèè è àòîìíî-ñèëîâîé ìèêðîñêîïèè îïðåäåëåíû óñëîâèÿ, ïðè êîòîðûõ ïðîèñõîäèò ïåðåõîä ìîëåêóë ïîëèìåðîâ àìèëîèä β ïåïòèäà è ëèçîöèìà èç íàòèâíîãîñîñòîÿíèÿ â ñîñòîÿíèå ñ íåïðàâèëüíîé óêëàäêîé.2. Âïåðâûå ïðè ïîìîùè ñèëîâîé ñïåêòðîñêîïèè è àòîìíî-ñèëîâîéìèêðîñêîïèè èçó÷åíî ìåæìîëåêóëÿðíîå âçàèìîäåéñòâèå ïîëèìåðîâ àìèëîèä β ïåïòèäà è ëèçîöèìà, íàõîäÿùèõñÿ â ñîñòîÿíèè ñ íåïðàâèëüíîé óêëàäêîé.23.

Âïåðâûå èññëåäîâàíî âëèÿíèå òåìïåðàòóðû, pH, âèäà ïîâåðõíîñòè è òèïà ñîðáöèèè íà êîíôîðìàöèþ ìîëåêóë àìèëîèä βïåïòèäà è ëèçîöèìà.4. Âïåðâûå îáíàðóæåíî, ÷òî âñå ýòè ôàêòîðû ìîãóò ïðèâîäèòü êèçìåíåíèþ êîíôîðìàöèè ìîëåêóë è ê ïîñëåäóþùåé àãðåãàöèèïîëèìåðîâ ñ îáðàçîâàíèåì ôèáðèëë.5. Âïåðâûå îáíàðóæåíî, ÷òî ìîëåêóëû ïîëèìåðîâ, ïðèâèòûå ê ïîâåðõíîñòè, ìîãóò àãðåãèðîâàòü è îáðàçîâûâàòü ôèáðèëëû.6.

Âïåðâûå îáíàðóæåíî, ÷òî õèìè÷åñêàÿ ñîðáöèÿ ìîæåò ñïîñîáñòâîâàòü àãðåãàöèè ïîëèìåðîâ.7. Îáíàðóæåíî, ÷òî õèìè÷åñêàÿ ñîðáöèÿ ìîëåêóë ëèçîöèìà ê ïîâåðõíîñòè çîëîòà è ôèçè÷åñêàÿ ñîðáöèÿ ìîëåêóë ëèçîöèìà íàïîâåðõíîñòü ãðàôèòà ïðèâîäèò ê ïîíèæåíèþ òåìïåðàòóðûêîíôîðìàöèîííîãî ïåðåõîäà èç íàòèâíîãî ñîñòîÿíèÿ âñîñòîÿíèå ñ íåïðàâèëüíîé óêëàäêîé ïî êðàéíåé ìåðå äîêîìíàòíîé òåìïåðàòóðû (20 ◦ Ñ).8.

Îáíàðóæåíî, ÷òî ôèçè÷åñêàÿ ñîðáöèÿ ìîëåêóë ëèçîöèìà íà ïîâåðõíîñòü ñëþäû è ñëþäû ñî ñëîåì 3-àìèíîïðîïèëñèëàòðàíàïðèâîäèò ê ïîíèæåíèþ òåìïåðàòóðû êîíôîðìàöèîííîãîïåðåõîäà èç íàòèâíîãî ñîñòîÿíèÿ â ñîñòîÿíèå ñ íåïðàâèëüíîé óêëàäêîé ïî êðàéíåé ìåðå äî 50 ◦ Ñ.3Íà çàùèòó âûíîñÿòñÿ ñëåäóþùèå ðåçóëüòàòû èïîëîæåíèÿ1. Îïðåäåëåíû óñëîâèÿ (òåìïåðàòóðà, pH, âèä ïîâåðõíîñòè è òèïñîðáöèè), ïðè êîòîðûõ àìèëîèä β ïåïòèä è ëèçîöèì ïåðåõîäÿòèç íàòèâíîé êîíôîðìàöèè (íåàìèëîèäîãåííîé êîíôîðìàöèè) âñîñòîÿíèå ñ íåïðàâèëüíîé óêëàäêîé (àìèëîèäîãåííóþ êîíôîðìàöèÿ).2. Îáíàðóæåíî, ÷òî àìèëîèä β ïåïòèä (pI = 5.5), õèìè÷åñêèñîðáèðîâàííûé íà ïîâåðõíîñòü ñëþäû, èçìåíÿåò ñâîþ êîíôîðìàöèþ ïðè ïîâûøåíèè êèñëîòíîñòè ñðåäû ñ ðÍ5.6 äî ðÍ3.7ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå.3. Îáíàðóæåíî, ÷òî ëèçîöèì (pI = 11), ôèçè÷åñêè ñîðáèðîâàííûé íà ãðàôèò, õèìè÷åñêè ñîðáèðîâàííûé íà ñëþäó èëè çîëîòî, èçìåíÿåò ñâîþ êîíôîðìàöèþ ïðè ïîâûøåíèè êèñëîòíîñòèñðåäû ñ ðÍ4.5 äî ðÍ3.0 ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå.4.

Îáíàðóæåíî, ÷òî ëèçîöèì, ôèçè÷åñêè ñîðáèðîâàííûé íà ñëþäó è ñëþäó, îáðàáîòàííóþ 3-àìèíîïðîïèëñèëàòðàíîì, èçìåíÿåò ñâîþ êîíôîðìàöèþ (ïðè ðÍ3.0) ïðè ïîâûøåíèè òåìïåðàòóðû äî 50 ◦ Ñ.5. Ýòîò êîíôîðìàöèîííûé ïåðåõîä ïðîèñõîäèò ïîä äåéñòâèåìðàçëè÷íûõ ôàêòîðîâ, òàêèõ êàê ïîíèæåíèå pH, ïîâûøåíèåòåìïåðàòóðû, áëèçîñòü ïîâåðõíîñòè èç-çà ôèçè÷åñêîé èëè õèìè÷åñêîé ñîðáöèè.6. Âñëåäñòâèè ýòîãî êîíôîðìàöèîííîãî ïåðåõîäà ïðîèñõîäèò çíà÷èòåëüíîå óâåëè÷åíèå âåðîÿòíîñòè âçàèìîäåéñòâèÿ äâóõ ìîëåêóë ìåæäó ñîáîé ïî ñðàâíåíèþ ñ íàòèâíîé êîíôîðìàöèåé (âêîòîðîé ìîëåêóëû ìåæäó ñîáîé ïî÷òè íå âçàèìîäåéñòâóþò),4íàïðèìåð, ñèëà âçàèìîäåéñòâèÿ äâóõ ìîëåêóë ðàâíà ∼ 40 ïÍäëÿ àìèëîèä β ïåïòèäà è ∼ 110 ïÍ äëÿ ëèçîöèìà.7.

Ýòî ìåæìîëåêóëÿðíîå âçàèìîäåéñòâèå ïðèâîäèò ê àãðåãàöèèàìèëîèä β ïåïòèäà è ëèçîöèìà. Ïðè ýòîì ìîãóò îáðàçîâûâàòüñÿ ëèíåéíûå ôèáðèëëû è ïîðîîáðàçíûå àãðåãàòû.8. Îáíàðóæåíî ôîðìèðîâàíèå ôèáðèëë ëèçîöèìà íà òâåðäîé ïîäëîæêå â óñëîâèÿõ, ïðè êîòîðûõ îíè íå îáðàçóþòñÿ â ðàñòâîðå.9. Îáíàðóæåíî ôîðìèðîâàíèå ôèáðèëë ëèçîöèìà, õèìè÷åñêèñîðáèðîâàííîãî íà ïîâåðõíîñòü çîëîòà è îòñóòñòâèå àãðåãàöèèëèçîöèìà, ôèçè÷åñêè ñîðáèðîâàííîãî íà ïîâåðõíîñòü çîëîòà.10.

Îáíàðóæåíî, ÷òî õèìè÷åñêàÿ ñîðáöèÿ ìîëåêóë ëèçîöèìà ê ïîâåðõíîñòè çîëîòà è ôèçè÷åñêàÿ ñîðáöèÿ ìîëåêóë ëèçîöèìà íàïîâåðõíîñòü ãðàôèòà ïðèâîäèò ê ïîíèæåíèþ òåìïåðàòóðû êîíôîðìàöèîííîãî ïåðåõîäà èç íàòèâíîãî ñîñòîÿíèÿ â ñîñòîÿíèå ñíåïðàâèëüíîé óêëàäêîé ïî êðàéíåé ìåðå äî êîìíàòíîé òåìïåðàòóðû.11. Îáíàðóæåíî, ÷òî ôèçè÷åñêàÿ ñîðáöèÿ ìîëåêóë ëèçîöèìà íàïîâåðõíîñòü ñëþäû è ñëþäû ñî ñëîåì ÀÏÑ ïðèâîäèò ê ïîíèæåíèþ òåìïåðàòóðû êîíôîðìàöèîííîãî ïåðåõîäà èç íàòèâíîãî ñîñòîÿíèÿ â ñîñòîÿíèå ñ íåïðàâèëüíîé óêëàäêîé ïî êðàéíåéìåðå äî 50 ◦ Ñ.Íàó÷íàÿ è ïðàêòè÷åñêàÿ öåííîñòüÂïåðâûå èçìåðåíî âçàèìîäåéñòâèå äâóõ ìîëåêóë àìèëîèä β ïåïòèäà è ëèçîöèìà, íàõîäÿùèõñÿ â ñîñòîÿíèè ñ íåïðàâèëüíîé óêëàäêîé.5Âïåðâûå îáíàðóæåíî, ÷òî ôèçè÷åñêàÿ è õèìè÷åñêàÿ ñîðáöèÿ ìîëåêóë ê ïîâåðõíîñòè ìîæåò ïðèâîäèòü ê èçìåíåíèþ êîíôîðìàöèèýòîé ìîëåêóëû.Âïåðâûå èññëåäîâàíî âëèÿíèå âèäà ïîâåðõíîñòè è òèïà ñîðáöèèíà òåìïåðàòóðó êîíôîðìàöèîííîãî ïåðåõîäà â ëèçîöèìå.Âïåðâûå èçó÷åíà àãðåãàöèÿ ëèçîöèìà íà ïîâåðõíîñòè â óñëîâèÿõ,êîãäà îíà íå ïðîèñõîäèò â ðàñòâîðå.Àïðîáàöèÿ ðàáîòûÎñíîâíûå ðåçóëüòàòû äèññåðòàöèîííîé ðàáîòû äîêëàäûâàëèñüíà ñëåäóþùèõ êîíôåðåíöèÿõ:1.

19th Annual Gibbs Conference on Biothermodynamics (ÑØÀ,2005). Conformation-dependent interprotein interaction studied byAFM force spectroscopy. E.V. Ukraintsev, T.O. Zaikova, J.F.W.Keana and Y.L.Lyubchenko;2. 19th Annual Gibbs Conference on Biothermodynamics (ÑØÀ,2005). Study of DNA-S I complex stability using AFM forcespectroscopy. A.V. Krasnoslobodtsev, L.S. Shlyakhtenko, E.V.Ukraintsev and Y.L.

Lyubchenko;3. International Conference on Nanoscience and Technology (Øâåéöàðèÿ, 2006). Atomic balance observation of protein aggregationon a cantilever surface. G. Kiselev, A.Kudrinskii, E.Ukraintsev, I.Yaminsky, G.Lisichkin;4. Òðåòüÿ Âñåðîññèéñêàÿ êîíôåðåíöèÿ (ñ ìåæäóíàðîäíûì ó÷àñòèåì), Õèìèÿ ïîâåðõíîñòè è íàíîòåõíîëîãèÿ (Ðîññèÿ, 2006).Èçó÷åíèå àãðåãàöèè ëèçîöèìà, èììîáèëèçîâàííîãî íà ïîâåðõíîñòè çîëîòà è ñëþäû, ñ ïîìîùüþ êàíòèëåâåðà äëÿ àòîìíîñèëîâîé ìèêðîñêîïèè. Å.Â.