Исследование электронного и протонного тарнспорта в фотосинтетических системах оксигенного типа с помощью спиновых меток, страница 3

Тем не менее, для этих меток также наблюдаютсяфотоиндуцированные изменения их спектров в хлоропластах. Поглощение этихметок хлоропластами, когда их концентрация внутри тилакоидов возрастает неболее, чем 10 раз, еще не сопровождается заметным искажением формы12спектра из-за эффекта концентрационного уширения. Таким образом,используя эти метки, можно измерять значения внутритилакоидного pH по pHзависимым изменениям спектров ЭПР.Применению изученных нами спиновых меток к измерениям pH внутритилакоидов посвящен следующий раздел III.6.

С использованием спиновыхметок ANT-3, ANT-4 и ANT-5, в присутствии парамагнитного уширителя CrOxв среде в концентрациях 8–16 мМ, показано, что при освещении изолированныххлоропластовкласса Бпроисходитзакислениевнутритилакоидногопространства; образующаяся при этом величина ∆pH > 2–2,5. Спектры ЭПРвнутритилакоидной фракции метки приведены на рис. 3.ANT-3ANT-5ANT-4СветТемнотаСветТемнотаСветТемнота(Хлоропласты)pH = 6,9pH = 5,1pH = 5,6pH = 8,0pH = 5,9pH = 7,9pH = 5,7(Буфер)32623266H (Э)327032623266H (Э)3270326232663270H (Э)Рис.3. Спектры ЭПР спиновых меток ANT-3, ANT-4 и ANT-5: вверху —внутренний сигнал в хлоропластах, в темноте и при освещении ( >15 с), вприсутствии каталазы и метилвиологена; внизу — в буферных растворахпри разных значениях pH.

Концентрации меток — 1 мМ, концентрацияхлоропластов соответствует ~5 мкМ P700 . Мощность СВЧ-излучения —10 мВт.13Последнийраздел III.7даннойглавыпосвященкислородчувствительной спиновой метке CxTPO. Спектр ЭПР данной метки обладаетсуперсверхтонкой структурой (суперСТС), хорошо разрешенной в анаэробныхусловиях (см. рис. 4). Изучена зависимость формы спектра от концентрациикислорода и концентрации самой метки, выбраны параметры спектра,чувствительные к концентрации кислорода и построены калибровочныезависимости.

Показано, что в изолированных хлоропластах > 90% кислорода,растворенного в среде, поглощается за время τ ≈ 15 с (при 1 мкМ P700). Втемноте происходит "регенерация" молекулярного кислорода за время τ < 70–150 с, что согласуется с данными, полученными при построенииматематической модели кинетики изменения величины сигнала ЭПР спиновыхметок, описанной в разд.

III.4.аАргонaВоздухbБуферα = a/bСвет(1 мин.)бТемнотаЦианобактерииСвет(3 мин.)3234Рис. 4. Спектры ЭПР спиновойметки CxTPO: а — в буфере, ватмосфереаргонаивравновесии с воздухом; б — всуспензиицианобактерийSynechocystis sp. 6803, помещенной в газонепроницаемуюкварцевую кювету, в темнотеи на свету. Концентрацияметки 0,1 мМ, амплитуда ВЧмодуляции магнитного поляHm = 0,025 Гс.∆H1∆H1323532363237H (Э)Глава IV посвящена исследованиям фотосинтетического электронноготранспорта в интактных фотосинтетических системах: в листьях древесныхрастений и в цианобактериях.14В разделе IV.1 описаны результаты исследований процессовфотосинтетического и дыхательного электронного и протонного транспорта,протекающих в тилакоидных мембранах цианобактерий.

Наше внимание былососредоточено, главным образом, на решении следующих вопросов:1) какие факторы, в первую очередь, контролируют электронный транспорт(ЭТ) в тилакоидных мембранах цианобактерий?2) Достигается ли при нормальной работе электрон-транспортных цепей (ЭТЦ)тилакоидной мембраны цианобактерий состояние дыхательного и/илифотосинтетического контроля? Если да, то какова величина коэффициентадыхательного (фотосинтетического) контроля?3) Какой вклад в вносят в трансмембранный протонный потенциалэлектрическая и концентрационная составляющие?4) Какие комплексы вносят основной вклад в суммарный ЭТ на различныхучастках тилакоидных ЭТЦ (дегидрогеназы, ФС 2, оксидазы, ФС 1)?α0.20.10.0αP1000.2P100500.15001000.0156 8 10.010.511.0время, мин.время, мин.Рис.

5. Фотоиндуцированные изменения величины сигнала ЭПР I (P)ипараметра α (см. определение на рис. 4) спектра ЭПР спиновой меткиCxTPO, инкубируемой в суспензии цианобактерий Synechocystis sp. 6803(дикий тип): вверху — клетки, подвергавшиеся заморозке, с добавлениемглицерина; внизу — клетки, не подвергавшиеся заморозке. Темноваяадаптация — 10 мин. Момент включения света показан вертикальнойстрелкой.Основные исследования были выполнены на клетках цианобактерииSynechocystis sp. PCC 6803 дикого типа, а также мутантных штаммов SDH–,NDH-ABC–, NDb–, OX–, PS2–, не имеющих одного или нескольких компонентовдыхательной или фотосинтетической ЭТЦ (сукцинатдегидрогеназы, NADH15дегидрогеназ 1 или 2, терминальных оксидаз или фотосистемы 2,соответственно).

Было показано, что:1) фотосинтетическийэлектронныйтранспортконтролируетсяпротонным потенциалом и скоростью оттока электронов на акцепторнойстороне ФС 1; роль последнего фактора становится решающей в анаэробныхусловиях. При этом наблюдается корреляция между фотоиндуцированнымипроцессами окисления P700 в ФС 1 и выделения кислорода в ФС 2 (рис. 5).2) Коэффициенты дыхательного и фотосинтетического контроля(замедление электронного транспорта из-за образования трансмембранногопротонного потенциала, измеренное в темноте и на свету, соответственно)составляют ~ 2,0 и ~ 2,8, соответственно (раздел IV.1.5) (см.

рис. 6)αWTCCCP0.15OXконтрольCCCP−0.10контроль0.050510010202530∆H1(Э)WT2.0контрольOX−контроль1.5CCCPCCCP1.005101520время, мин.250 10202530время, мин.35Рис. 6. Изменение параметров α и ∆H1 (определения α и ∆H1 см. на рис. 4)спектра ЭПР спиновой метки CxTPO, инкубируемой в суспензиицианобактерий Synechocystis sp. 6803, дикого типа (слева) и OX– мутанта(справа), не подвергавшихся заморозке, в кварцевой кювете. Освещениебелым светом — в течение 6 мин (моменты включения и выключения светапоказаны вертикальными стрелками).

Концентрация CCCP — 80 мкМ.163) Основной вклад в протонный потенциал, влияющий на скоростьдыхания, вносит его концентрационная составляющая ∆рН (раздел IV.1.5).4) Основной вклад (до 80%) в приток электронов в цепь переноса междудвумя фотосистемами со стороны дыхательной цепи в темноте вносит SDH.

Вусловиях освещения относительный вклад циклического транспорта электроновв суммарный поток электронов к Р700+ составляет ~30-60% от полного потокаэлектронов, включающего поток электронов от ФС 2. (раздел IV.1.3).5) Основной вклад в электронный транспорт на участке ЭТЦ после PQвносит ФС 1, вклад терминальных оксидаз тилакоидной мембраны в условияхосвещения практически незаметен ( > 10%) (раздел IV.1.4).6) Поглощение кислорода клеткой подавляется цианидом (20 мМ) на~85%. Неспецифическое поглощение кислорода, сохраняющееся в отсутствиетерминальных оксидаз, составляет менее 5% (раздел IV.1.2).Раздел IV.2 посвящен исследованиям фотосинтетических характеристикдревесных растений, произрастающих в естественных условиях в черте города.Поскольку, как известно, одной из главных экологических проблем городаМосквы является обилие автотранспорта, нами для исследований быливыбраны условия, в которых именно этот антропогенный фактор проявляетсянаиболее заметно: был исследован участок парка МГУ им.

М.В.Ломоносова,примыкающий к двум оживленным транспортным магистралям.В нашемисследовании мы попытались ответить на три вопроса:1) какиепоказателифотосинтезанаиболеечувствительныкзагрязненности среды произрастания растений продуктами автомобильныхвыхлопов;2) какие изменения в фотосинтетическом аппарате растений происходятпод действием этого антропогенного фактора;3) на каких характерных расстояниях от источника загрязнения (дороги)проявляется его влияние в естественных (городских) условиях.

Очевидно,последний вопрос имеет также большое практическое значение.Работа включала измерения фотосинтетических характеристик листьев сприменениемтрехразныхбиофизическихметодов:электронногопарамагнитного резонанса (ЭПР), медленной индукции флуоресценции (МИФ;совместно с В.А. Караваевым) и термолюминесценции (ТЛ; совместно сМ.К. Солнцевым); регистрировали также спектры флуоресценции и содержаниеразных форм хлорофилла в исследуемых образцах. Измерения проводились нарастениях нескольких видов (клен платановидный, Acer platanoides L., клен17американский, A. negundo L., рябина обыкновенная, Sorbus aucuparia L., липамелколистная, Tilia cordata L.); бо`льшая часть результатов была получена налистьях Рябины обыкновенной.

В результате этой работы было показано, что:1) "кинетические" характеристики фотосинтетических процессов влистьях растений (времена фотоиндуцированного окисления P700, тушенияМИФ и т.п.) более чувствительны к условиям произрастания растений, чем"стационарные" показатели.2) Для древесных растений, произрастающих в составе относительногустых посадок ("лес") вдоль автомобильной дороги, основные показателифотосинтетической активности перестают заметно меняться при удалении отнее, начиная с 50–70 м (см. рис. 7). Это позволяет предположить, чтохарактерная "глубина проникновения" автомобильных выхлопов в лесопосадкисоставляет около 50–70 м, и растения, произрастающие на бо'льшихрасстояниях от дороги, относительно слабо испытывают ее антропогенноевоздействие.τ1/2 (с)P80τ1/26040200.00.5 1.0время, с1.520 40 60 80растояние от дороги, мРис. 7. Зависимость индукционного времени τ1/2 фотоиндуцированногоокисления P700 листьев рябины от расстояния места произрастаниярастения от дороги.Исследования, описанные в Главе V, выполнены на изолированнойсистеме (хлоропластах класса Б).

Предметом этих исследований являетсявзаимодействие фотосинтетического аппарата с природным пигментомамарантином, который, возможно, играет роль в регуляции фотосинтетическихпроцессов in vivo в растениях порядка Centrospermae, и, в частности, родаAmaranthus. Методом ЭПР были исследованы фотоиндуцированныеокислительно-восстановительные превращения P700 в хлоропластах растенийнескольких видов (бобов (Vicia faba L.), амаранта (Amaranthus tricolor L.) ишпината (Spinacia oleracea L.)) и участие в них амарантина, а также реакций18протонного транспорта в присутствие амарантина.

В итоге было показано, чтоамарантин может взаимодействовать с ЭТЦ хлоропластов, восстанавливаясь засчет взаимодействия с ФС 2. Кроме того, в хлоропластах амаранта амарантинприводит к частичному восстановлению реакционных центров ФС 1. При этомамарантин практически не оказывает влияние на светозависимое образованиетрансмембранной разности pH.Диссертация также содержит три приложения.Приложение 1 содержит расчет распределения молекул спиновой меткив хлоропластах, возникающее при закислении внутритилакоидногопространства за счет работы фотосинтетической ЭТЦ. Результаты этого расчетаиспользуются для построения полуэмпирической модели фотоиндуцируемыхизменений величины спектра ЭПР спиновой метки в хлоропластах, описанной вразделе III.4.Приложение 2 представляет собой дополнение к разделу III.3 и содержитне включенные в него экспериментальные данные по фотоиндуцированнымизменениям величины сигнала ЭПР всех исследованных в данной работеимидазолиновых и имидазолидиновых спиновых меток в хлоропластах.Приложение 3 содержит экспериментальные данные, полученные приисследовании цианобактерий, не связанные непосредственно с вопросами,поставленными нами в разделе IV.1.