Исследование электронного и протонного тарнспорта в фотосинтетических системах оксигенного типа с помощью спиновых меток

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТим. М.В. Ломоносова_____________________________________________________________________Физический факультетНа правах рукописиУДК 577.3Птушенко Василий ВитальевичИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРОННОГО И ПРОТОННОГО ТРАНСПОРТАВ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ ОКСИГЕННОГО ТИПАС ПОМОЩЬЮ СПИНОВЫХ МЕТОК03.00.02 – биофизика03.00.16 – экологияАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата физико-математических наукМосква – 2006 г.Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультетаМосковского государственного университета им. М.В. ЛомоносоваНаучный руководитель:доктор физико-математических наук,профессорТихонов Александр НиколаевичОфициальные оппоненты:доктор физико-математических наук,профессор Рууге Энно Куставичкандидат биологических наук,доцент Тимофеев Кирилл НиколаевичВедущая организация:Институт Химической Физики РАНим.

Н.Н. СеменоваЗащита диссертации состоится «27» апреля 2006 года в _____ часов назаседании диссертационного совета К 501.001.08 при Московскомгосударственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992,ГСП-2, г. Москва, Воробьевы горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, физическийфакультет, Малая физическая аудитория .С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультетаМГУ им. М.В. Ломоносова.Автореферат разослан _____________ 2006 года.Ученый секретарьдиссертационного совета К 501.001.08.кандидат физико-математических наукГ.Б. Хомутов1.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность темыОткрытие электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) ЕвгениемКонстантиновичем Завойским в 1944 г. (Альтшулер и др., 1944; Завойский,1944–1945; Zavoisky, 1945–1946), дало науке новый мощный методисследования, который благодаря пионерским работам Б. Коммонера(Commoner et al., 1954) и Л.А. Блюменфельда (Блюменфельд, 1957;Блюменфельд и Калмансон, 1957) вошел в биологию и в последние полвекаявляется одним из основных биофизических методов исследования.Появившийся в 1960-х гг. благодаря работам А.Б.

Неймана, Х. Мак-Коннела,А.Л. Бучаченко, А.Н. Кузнецова, Г.И. Лихтенштейна метод спиновых зондов(или спиновых меток), основанный на явлении ЭПР, сделал возможнымисследование биологических систем на самых разных уровнях их структурнойи функциональной организации.Одной из наиболее актуальных задач современной биофизики являетсяизмерение pH среды в микрообъемах.

В биоэнергетике точное измерение pH вмикроскопических везикулах митохондрий или внутрихлоропластныхобразований — тилакоидов — связано с разрешением двух принципиальныхвопросов: а) какой механизм сопряжения — локальный или нелокальный —обеспечивает синтез ATP в энергетических органеллах клетки, и б) каковаотносительная роль двух составляющих трансмембранного протонногопотенциала в этом синтезе. Измерение pH с помощью pH-чувствительныхспиновых меток уже более 20 лет используется в различных областях химии,биологии и медицины, однако в исследованиях процессов фотосинтеза pHчувствительные спиновые метки до сих пор не получили должногоприменения.

Измерение pH в микроскопических объемах тилакоидов,содержащих реакционноспособные компоненты электрон-транспортной цепи(ЭТЦ), требует разработки специальных методов регистрации и обработкиспектров ЭПР спиновых меток и подбора подходящих условий измерений(Trubitsin & Tikhonov, 2003; Tikhonov & Subczynski, 2005). В последние годыбыло синтезировано большое количество новых pH-чувствительных спиновыхметок (Khramtsov et al., 2000; Kirilyuk et al., 2004, 2005; Voinov et al., 2005),обладающих широким спектром физико-химических свойств, что раскрываетширокие возможности для проведения подобных исследований.

В связи с этимактуальной задачей для биофизики фотосинтеза является исследование свойств3новых pH-чувствительных спиновых меток и возможностей их применения дляизмерения внутритилакоидного pH в изолированных хлоропластах растений.Большинствоисследованийфотосинтезаосуществляетсянаизолированных фотосинтетических системах: на отдельных изолированныхфотосинтетических комплексах либо на препаратах изолированных тилакоидов(или на хлоропластах класса Б).

Однако для изучения регуляции световыхстадий фотосинтеза и взаимодействие между разными биохимическимисистемами фотосинтезирующей клетки необходимо исследование интактныхфотосинтетических систем. Одной из наиболее удобных интактныхфотосинтетических систем оксигенного типа являются клетки цианобактерий.Примером другой интактной фотосинтетической системы оксигенноготипа являются хлоропласты растений in situ, в живом листе. При этомисследование процессов электронного фотосинтетического транспорта влистьях древесных растений, произрастающих в открытом грунте натерритории г.

Москвы важно не только с точки зрения биофизики фотосинтеза,но имеет также практическую ценность (для охраны окружающей среды).Цели и задачи работыОсновной целью данной работы является изучение электронного ипротонного транспорта в фотосинтетических системах оксигенного типа, вособенности — интактных, а также исследование возможностей примененияряда имидазолиновых и имидазолидиновых кислород- и pH-чувствительныхспиновых меток для изучения световых стадий фотосинтеза.В соответствии с поставленной целью были определены следующиезадачи:1) изучить физико-химические и биологические свойства ряда новыхимидазолиновых и имидазолидиновых спиновых меток, их взаимодействие схлоропластами и цианобактериями, и разработать алгоритм измерения ∆pH иконцентрации кислорода по фотоиндуцированным изменениям спектров ЭПРспиновых меток;2) изучить (с использованием методов ингибиторного анализа, а такжефотосинтетических и дыхательных мутантов цианобактерий Synechocystis sp.PCC 6803 и Synechococcus sp.

PCC 7942), какие факторы контролируютэлектронный транспорт (ЭТ) в тилакоидных мембранах цианобактерий икакие фотосинтетические и дыхательные комплексы вносят основной вклад в4суммарный ЭТ на различных участках тилакоидных цепей транспортаэлектронов;3) определить, какие показатели фотосинтеза наиболее чувствительны кзагрязненности среды произрастания растений продуктами автомобильныхвыхлопов, изучить характер изменений этих параметров и выяснить, какиеизменения в фотосинтетическом аппарате растений происходят поддействием этого антропогенного фактора;4) изучить механизмы влияния природного пигмента амарантина на процессытранспорта электронов в хлоропластах.Научная новизна работыВпервые получены сигналы ЭПР ряда имидазолиновых нитроксильныхрадикалов (ANT-1, ANT-3, ANT-4, ANT-5), локализованных вовнутритилакоидном пространстве.

Показано, что эти pH-чувствительныеспиновые метки могут быть использованы для измерения ∆pH в хлоропластах.Показано, что скорость оттока электронов от ФС 1 являетсясущественным фактором регуляции электронного транспорта в клеткахцианобактерии Synechocystis sp.

PCC 6803, причем в анаэробных условияхотток электронов от ФС 1 является лимитирующим звеном в работефотосинтетической цепи переноса электронов. Показана корреляция междуфотоиндуцированными процессами окисления P700 в ФС 1 и выделениякислорода в ФС 2. Установлено, что замедление скоростей дыхания (в темноте)и переноса электронов на участке между двумя фотосистемами (в условияхосвещения) в клетках цианобактерии Synechocystis sp.

PCC 6803 обусловлено, восновном, концентрационной составляющей (∆рН) протонного потенциала.Определены «кинетические» параметры фотосинтетических процессов влистьях растений, измеряемые методом ЭПР и медленной индукциифлуоресценции, чувствительные к условиям произрастания растений, включаянеблагоприятные антропогенные факторы внешней среды.Предложен механизм возможного участия беталаинового пигментаамарантина в реакциях транспорта электронов in vitro.Практическая ценностьПолученные в диссертации данные о физико-химических ибиологическихсвойствахисследованныхимидазолиновыхиимидазолидиновых спиновых меток могут быть использованы в разнообразных5физиологических, биофизических, физико-химических задачах с применениемэтих меток.

Предложенная в диссертации полуэмпирическая модель,описывающая фотоиндуцированные изменения величины сигнала ЭПР метки,может быть в дальнейшем использована для экспресс-оценки свойств новыхспиновых меток (эффективность взаимодействия с цепью переноса электроновхлоропластов,стабильностьрадикальнойформы,эффективностьпарамагнитного взаимодействия молекул метки с кислородом, как с"релаксационным" и "уширяющим" агентом, и т.п.).Полученные в диссертации данные об изменении биофизическихпоказателей листьев растений, произрастающих вблизи транспортныхмагистралей, могут быть использованы при организации защитных зеленыхнасаждений (лесополос), для оценки их эффективности.Апробация работы и публикацииОсновныерезультатыдиссертациибылипредставленынаIII Всероссийской научной конференции “Физические проблемы экологии(Физическая экология)” (Москва, 1997), на Международной конференциистудентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2001",секция "Физика" (Москва, 2001), на IV Международном симпозиуме «Новые инетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2001),на Международной конференции “Актуальные вопросы экологическойфизиологии растений в XXI веке“ (Сыктывкар, 2001), на XXXV Ежегодноммеждународном съезде "Annual International Meeting: Advanced Techniques andApplications of EPR" (Aberdeen, Scotland, UK, 2002), на Молодежной школеконференции "Современные проблемы биохимической физики" (Москва, 2002),на V Международном съезде Европейской федерации ЭПР "Meeting of theEuropean Federation of EPR Groups" (Lisbon, Portugal, 2003), наXIII Европейской биоэнергетической конференции EBEC (Pisa, Italy, 2004).По материалам диссертационной работы опубликовано 11 печатныхработ.Структура и объем диссертацииДиссертация изложена на 290 стр., содержит 97 рис.