Исследование электронного и протонного тарнспорта в фотосинтетических системах оксигенного типа с помощью спиновых меток, страница 2

и 3 табл. (в т.ч.20 стр.,14 рис.вприложениях),списоклитературысодержит146 библиографических ссылок. Диссертация состоит из введения, 5 глав,выводов, списка литературы и трех приложений.62. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫВовведенииобоснованаактуальностьтемыдиссертации,сформулированы цели и основные задачи работы.Глава I диссертации представляет собой обзор литературы, которыйсостоит из двух частей. В первой части приведены современные данные осветовых стадиях фотосинтеза и структурно-функциональной организациифотосинтетического аппарата цианобактерий и хлоропластов высших растений.Проведено сравнение электрон-транспортных цепей (ЭТЦ) хлоропластов ицианобактерий. Рассмотрены данные о взаимодействии фотосинтетической идыхательной ЭТЦ в клетках цианобактерий и высших растений, окомпонентном составе хлоропластной и цианобактериальных ЭТЦ, осоотношении активностей и локализации отдельных компонент, опространственной организации фотосинтетического и дыхательного аппаратов.Особое внимание уделено анализу возможных путей электрона в ходеэнергодонорныхэлетрон-транспортныхпроцессов(нециклический,псевдоциклический, "короткий" и "длинный" циклические пути) и механизмоврегуляции электронного и протонного транспорта в цианобактериях ихлоропластах.Вторая часть Главы I посвящена применениям кислород- и pHчувствительных спиновых меток в исследованиях фотосинтеза.

Проведеносравнение различных методов измерения pH внутри тилакоидов, основанных наприменении спиновых меток.Глава II посвящена описанию материалов и методов, использованных вдиссертационной работе. Объектами исследования служили следующиефотосинтетические системы:• изолированные хлоропласты бобов (Vicia faba L., сорт «Русские черные»),амаранта (Amaranthus tricolor L., сорт «Валентина») и шпината (Spinaciaoleracea L., сорт «Стоик»);• цианобактерии Synechocystis sp., strain PCC 6803, дикий тип и мутанты PSIIless (без ФС 2), OX-less (без терминальных окисдаз), SDH-less (без SDH), NDHABC-less (без NDH-1) и NDb-less (без NDH-2); Synechococcus sp., strain PCC7942, дикий тип и мутант FTN2 (обладающий длинными клетками);• листья бобов (Vicia faba L., сорт «Русские черные»), пшеницы (Пшеницамягкая, Triticum aestivum L.) и древесных растений нескольких видов (Кленплатановидный, Acer platanoides L., Клен американский, A.

negundo L., Рябинаобыкновенная, Sorbus aucuparia L., Липа мелколистная, Tilia cordata L.).7NNHNNNNNNOOANT-1(KG-2)1NNANT-2(KG-1)1NNNOOANT-3(HMI)2ANT-4(KG-4)1NNO2NNNH2NNNNHNNNNOOOOANT-5(KG-5)1NH3ANT-8(KG-3)1ATI(SL-11)3NTI(SL-7)3+COOHNNOOTACxTPO453N1O425NN132OРис. 1. Кислород- и pH-чувствительные нитроксильные радикалы. Обозначениявведены в (Птушенко, 2002). В скобках приведены синонимы,встречающиеся в литературе: 1 — (Tikhonov e.a., 2003), 2 — (Foster e.a.,2003), 3 — (Khramtsov & Volodarsky, 1998).Кинетику фотосинтетического транспорта электронов во всехисследуемых объектах изучали по фотоиндуцируемым изменениям величинысигнала ЭПР I от окисленных реакционных центров ФС 1 (P700+). Для анализаработы ФС 2 и комплексов дыхательной ЭТЦ цианобактерий измеряликонцентрацию кислорода в среде полярографическим методом и методом ЭПРс помощью кислород-чувствительной спиновой метки CxTPO (см.

рис. 1). Дляизмерения внутритилакоидного pH в хлоропластах использовали pH8чувствительные спиновые метки, приведенные на рис. 1. Спектрывнутритилакоидной фракции молекул метки вычленяли с помощьюнепроникающего через мембрану парамагнитного уширителя оксалата хрома(CrOx). Измерение скорости фосфорилирования в изолированных хлоропластахпроводили pH-метрическим методом (по защелачиванию среды при синтезеATP). Целостность тилакоидных мембран хлоропластов проверяли по эффектуфотоиндуцированого уширения спиновой метки TA, поглощаемой тилакоидамив ответ на закисление внутритилакоидного пространства.

Целостностьхлоропластной мембраны проверяли по фотоиндуцированному восстановлениюферрицианида хлоропластами, которая также измерялась pH-метрически (позащелачиванию среды при восстановлении феррицианида).Изложение результатов диссертационной работы составляет содержаниепоследних трех глав (главы III–V) и построено следующим образом. Глава IIIносит "инструментальный" характер: она содержит подробное описаниесвойств кислород- и pH-чувствительных спиновых меток, анализ возможностиих применения в исследованиях фотосинтеза и некоторые полученные с ихпомощью результаты, относящиеся к наиболее простым модельнымфотосинтетическим системам — изолированным хлоропластам класса Б.Глава IV (и дополняющее ее Приложение 3) описывает исследованияинтактных фотосинтетических систем, в которых находят свое применениенекоторые из исследованных в предыдущей главе спиновых меток.

Каждому изисследуемых интактных фотосинтетических объектов — цианнобактериям илистьям древесных растений — посвящен отдельный раздел главы. В первомразделе, посвященном цианобактериям, исследуются изменения ихбиофизических характеристик под действием контролируемого влияния нафотосинтетический аппарат (с использованием ряда мутантов и методовингибиторного анализа). На полученные при этом результаты отчастиопирается содержание второго раздела, в котором описывается втораяинтактная система — листья древесных растений, произрастающих в разныхусловиях городской среды обитания. Главная задача этого раздела — анализсостояния фотосинтетического аппарата этих растений на основаниинаблюдаемых изменений (под действием антропогенных влияний) ихбиофизических характеристик.

Последняя Глава V, хотя и посвященаисследованиям, выполненым на изолированной системе (на изолированныххлоропластах класса Б), однако предметом исследований являетсявзаимодействие фотосинтетического аппарата с природным пигментом9(амарантином),который,возможно,играетрольврегуляциифотосинтетических процессов in vivo в растениях порядка Centrospermae(Кононков, Гинс, 1997).

Опишем теперь подробнее содержание каждой изглав III–V.Глава III посвящена описанию результатов исследований свойствкислород- и pH-чувствительных спиновых меток и их взаимодействия схлоропластами; глава содержит 7 разделов.Раздел III.1 содержит описание физико-химических свойств pHчувствительных спиновых меток, приведенных на рис.1. Приведены спектрыметок в буферных водных растворах, зависимости параметров спектров ЭПР отpH и от концентраций меток.

Исследовано влияние кислорода и некоторыхсолей на спектры ЭПР нитроксильных радикалов.В разделе III.2 описано взаимодействие pH-чувствительных спиновыхметок с хлоропластами: окислительно-восстановительные превращенияспиновыхметокпривзаимодействиисхлоропластнойЭТЦ,фотоиндуцированноепоглощениемолекулметкитилакоидами,фотоиндуцированное связывание и диссоциация молекул метки с тилакоидноймембраной. Показана связь между фотоиндуцированным поглощением,интенсивностью редокс-превращений и величиной pKa метки. Показано, чтометки ATI, NTI и ANT-3 не оказывают заметного разобщающего действия натилакоидные мембраны в концентрациях, используемых для измеренийвнутритилакоидного pH (≤ 3 мМ).Основные результаты, касающиеся кислород-зависимых измененийспектров ЭПР pH-чувствительных спиновых меток в хлоропластах, вынесены вотдельный раздел III.3. Основные исследования выполнены на метке ANT-3,для которой исследовано влияние разнообразных факторов на кинетикуфотоиндуцированных изменений величины ее сигнала ЭПР в хлоропластах:влияние условий газообмена и активных форм кислорода, режимафункционирования ЭТЦ, концентрации метки и содержания активнофункционирующих ЭТЦ в суспензии.

В результате было показано, что вусловиях наших экспериментов главную роль в изменении спектра меткииграют следующие факторы:1) редокс-превращения молекул спиновой метки при их взаимодействии с ЭТЦхлоропластов, приводящие к потере молекулами метки парамагнитных свойств;2) влияние кислорода как парамагнитного уширителя спектра ЭПР при низкихзначениях мощности СВЧ (PСВЧ < 10 мВт);103) влияние кислорода как парамагнитного «релаксатора» при высокихзначениях мощности СВЧ (PСВЧ > 10 мВт);4) концентрационно-зависимые изменения спектра метки, обусловленныефотоиндуцированнымперераспределениеммолекулметкимеждукомпартментами хлоропластов (поглощение молекул метки тилакоидами).A'1(у.е.)экспериментA'1H max1003235532401243500ANT-3модель1001243500060120180240Рис. 2.Кинетикафотоиндуцированных измененийамплитуды(A'1)низкополевойкомпонентыспектраЭПРспиновойметки ANT-3 в хлоропластах: 1 — контроль,PСВЧ = 1 мВт; 2 — контроль,PСВЧ = 100 мВт; 3 — вприсутствии NH4Cl, PСВЧ =1 мВт; 4 — в присутствииNH4Cl, PСВЧ = 100 мВт; 5 —в присутствии каталазы,PСВЧ = 1 мВт.

Концентрацияметки — 1 мМ, концентрация хлоропластов соответствует1 мкМP700.Вертикальными стрелкамипоказаны моменты включения и выключения белогосвета.300время, сВклад каждого их этих факторов в фотоиндуцированные измененияспектра спиновой метки различен для разных меток и определяетсяинтенсивностью ее взаимодействия с ЭТЦ хлоропластов, степеньюуширяющего и "релаксаторного" влияния кислорода при разных егоконцентрациях, а также трансмембранной разностью pH, скоростью переносаэлектронов по ЭТЦ и активностью хлоропластной каталазы. Дляколичественного определения перечисленных характеристик метки и еевзаимодействия с хлоропластами на основании наблюдаемых в экспериментефотоиндуцированных изменений величины сигнала ЭПР метки, мы11разработалипростуюматематическуюполуэмпирическуюмодель,учитывающую влияние всех перечисленных выше факторов на величинусигнала ЭПР спиновой метки.

Описанию этой модели и полученных с еепомощью результатов посвящен раздел III.4. Показано, что в хлоропластахкласса Б, выделяемых по используемой нами методике, при освещениипроисходит уменьшение концентрации растворенного молекулярногокислорода (за счет неполного разложения перекиси водорода, образующейся входе псевдоциклического электронного транспорта) за характерное время ~ 50–100 с при концентрации хлоропластов, соответствующей ~ 1 мкМ P700. Втемноте наблюдается "регенерация" кислорода (по-видимому, за счет действияхлоропластной каталазы) с характерным временем ~ 50–100 с. Наилучшеесоответствие модельных кривых экспериментальным достигается при величине∆pH ~ 3, причем характерное время образования ∆pH на свету составляет 4–7 с,а время рассеяния ∆pH в темноте — ~10 с.

Добавление в суспензиюразобщителя (NH4Cl) ускоряет восстановление метки в 3–5 раз; примерно востолько же ускоряется и фотоиндуцированное поглощение кислорода.Типичные экспериментальные и модельные кинетические кривые для меткиANT-3 приведены на рис. 2.В разделе III.5 суммируются данные, полученные по физикохимическим свойствам исследованных нами спиновых меток (ANT-1, ANT-2,ANT-3, ANT-4, ANT-5, ANT-8, ATI, NTI) и их взаимодействию схлоропластами, описанные в предыдущих разделах данной главы, и делаютсявыводы о возможности их применения для измерения pH внутри тилакоидов(pHin).

Так, pH-чувствительные спиновые метки ANT-1, ANT-2, ANT-3, ATI,обладающие значениями pK ниже 6,5-7,0 , являются наиболее перспективнымидля измерений pHin по эффекту pH-зависимого изменения формы спектра меткипри ее протонировании/депротонировании. Спектры ЭПР этих меток наименееподвержены искажениям за счет быстрой потери молекулами метки еепарамагнитных свойств и/или эффекта концентрационного уширения приперераспределении метки внутри хлоропласта. Метки ANT-4, ANT-5, ANT-8,NTI, обладающие значениями pK ≥ 7, имеют спектры ЭПР, которые могутзаметно искажаться в результате концентрационного уширения и потерипарамагнетизма.