Диссертация (Взаимодействие эритроцитов в средах, индуцирующих их агрегацию - исследование с помощью лазерных пинцетов), страница 2

500 и 70кДа). Проведены анализ и сравнение результатов измерения, сделана оценка ихсоответствия существующим моделям взаимодействия эритроцитов. Было развитопредставление о механизмах взаимодействия эритроцитов при их агрегации.Цель и задачи работыЦелью работы является изучение механизмов взаимодействия отдельныхэритроцитов при их агрегации и дезагрегации и выявление роли макромолекул в этомпроцессе с помощью лазерных пинцетов. Для достижения этой цели необходиморешить следующие задачи:8Разработатьпротоколиспользованиялазерныхпинцетовдляизмеренияпараметров, характеризующих взаимодействие эритроцитов при их агрегации идезагрегации.Измерить параметры, характеризующие взаимодействие эритроцитов при ихагрегации в плазме и сыворотке крови, а также в модельных растворах белков инейтральных макромолекул, и провести их сравнение.Развить модель, описывающую механизм взаимодействия эритроцитов на базерезультатов измерений, проведенных с помощью лазерных пинцетов.Положения, выносимые на защиту:1.

Спонтанная агрегация двух одиночных эритроцитов с образованием парногоагрегата не происходит в растворах, содержащих только молекулы альбумина илитолько молекулы фибриногена вплоть до концентрации двойне превышающейфизиологическую норму.2. Значительная роль фибриногена в процессе спонтанной агрегации эритроцитовпроявляется только в совокупности с другими компонентами крови.3.Спонтанная агрегация эритроцитов (САЭ) и дезагрегация эритроцитов (ДАЭ) вплазме не являются абсолютно обратными процессами.

Сила взаимодействияэритроцитов при САЭ уменьшается пропорционально площади взаимодействияэритроцитов. При ДАЭ она, напротив, возрастает по мере разделения клеток.4.Процесс взаимодействия клеток в плазме и сыворотке отличается от того, чтонаблюдается в модельных растворах нейтральных макромолекул. В растворахнейтральных макромолекул силы взаимодействия клеток как при спонтаннойагрегации, так и при дезагрегации уменьшаются пропорционально площадивзаимодействия.95.Модель «подвижных мостиков» применимадля описания взаимодействияэритроцитов в плазме. Возрастание энергии взаимодействия клеток по мере ихразделения описывается подвижностью связей (мостиков) и их аккумуляцией.6.Энергия взаимодействия эритроцитов в растворе декстрана остается постояннойпо мере их разделения.Апробация результатовРезультаты работы были представлены на 14 российских и международныхконференциях: «15th International Congress of Biorheology and 8thInternationalConference on Clinical Hemorheology» (Сеул, Корея, 2015), «V International Symposium Topical Problems of Biophotonics» (Nizhny Novgorod, Russia, 2015), «Международнаянаучная конференция - Микроциркуляция и Гемореология» (Ярославль, Россия 5-8июля 2015), «International conference - BioPhotonics 2015» (Florence, Italy, 2015), «7thFinnish-Russian Photonics and Laser Symposium» (Saratov, Russia, 2014), «Saratov FallMeeting - SFM’14» (Saratov, Russia, 2014), «The 23th Annual International Conference onAdvanced Laser Technologies» (Faro, Portugal, 2015), «VI Троицкая КонференцияМедицинская Физика и Инновации в Медицине» (Троицк, Россия, 2014), «LaserApplications in Life Science» (Ульм, Германия, 2014), «6th Finnish-Russian Photonics andLaser Symposium 2013» (Куопио, Финляндия, 2013), «Topical Problems of Biophotonics2013» (Нижний Новгород, Россия, 2013), «Hemorheology and Microcirculation»(Ярославль, Россия, 2013), «Russia-Taiwan School-Seminar on Nonlinear Optics andPhotonics» (Владимир, Россия, 2013), “Photonics and Imaging in Biology and Medicine”(Ухань, Китай, 2013).10ПубликацииОсновные результаты диссертационной работы опубликованы в 3-х статьях внаучных журналах из списка ВАК России.Структура и объем диссертацииДиссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и спискалитературы.

Объем диссертации составляет 95 страниц, включая список литературы,36 рисунков и 2 таблицы. Список цитированной литературы содержит 143наименований, включая публикации автора по теме диссертации.11Глава 1. Обзор литературы1.1. Определение агрегации эритроцитовАгрегация эритроцитов (АЭ) – это обратимый процесс образования иразрушения агрегатов эритроцитов.

В крови человека, в системе кровообращения вусловиях низкого сдвигового напряжения эритроциты, соприкасаясь друг с другом,спонтанно (самопроизвольно) притягиваются друг к другу и образуют агрегаты –линейные структуры, которые разрушаются в более мелких сосудах и при болеевысоких сдвиговых скоростях [1-4]. На рисунке 1.1 представлены микрофотографиинеагрегированных (а) и агрегированных (б) эритроцитов на предметном стекле,полученные с помощью оптического микроскопа [5].

В плазме эритроциты образуюттак называемые «монетные столбики», спонтанно наползая друг на друга привозникновении локального контакта.Рис. 1.1. Эритроциты (а) в PBS, (б) в аутологической плазме. Эритроциты агрегируют в плазмеи образуют «монетные столбики». Маленькие частицы, наблюдаемые на микрофотографиях –тромбоциты [5].В данной работе для того, чтобы различать процессы спонтанной агрегацииэритроцитов и дезагрегации эритроцитов, мы обозначим их САЭ и ДАЭсоответственно. В большинстве известных нам работ авторы не различают САЭ и12ДАЭ, считая, что они являются абсолютно обратными процессами, характеризующиесяодинаковой динамикой. Поэтому в данной главе мы в основном будем использоватьтермин АЭ, не указывая специфично, к какому из процессов относятся результаты.

Вглавах 2-4 мы покажем отличие САЭ от ДАЭ и будем использовать в основном этитермины.Хотя в работе будет рассмотрена только АЭ, следует отметить еще односвойство эритроцитов крови, определяющее её текучесть. Это деформируемостьклеток.Рольдеформируемостиэритроцитоввосновномпроявляетсявмикрокапиллярах, для прохождения эритроцитов по которым требуется их высокаяэластичность. Интенсивные исследования проводятся и по изучению деформируемостиэритроцитов [6-14], однако в данной работе этот вопрос рассматриваться не будет.1.1.1. История открытия агрегации эритроцитовВпервые наблюдение АЭ было произведено Уильямсом (Williams) в 1773 году.

Онотметил следующее: “Необходимо отметить, что через несколько минут после того,как эритроциты распределяются по стеклу, они объединяются в кластеры иприкрепляются друг к другу…” (“It is necessary to remark, that in a few minutes afterparticles are spread out on glass, they run in clusters and stick to each other…”).

Ноподробное же изучение АЭ было произведено только в начале двадцатого века,Фареусом (Fåhræus) [15,16,17,18]. Он впервые установил, наблюдая поведениеэритроцитов с помощью микроскопа, что эритроциты здоровых людей образуютагрегаты из всего нескольких клеток и легко разрушаются. Эритроциты же больныхлюдей, напротив, образуют большие кластеры, для разрушения которых требуетсябольше усилий. Таким образом, Фареус положил начало исследованиям АЭ.131.1.2.

Физиологическая роль агрегации эритроцитовАгрегация эритроцитов является одним из основных процессов, определяющихвязкость и, тем самым, микроциркуляцию крови. Этот процесс особо интересен тем,что он в значительной степени изменяется при патологиях [2,12,19,20]. С точки зрениявзаимосвязи с распространенными методами клинической диагностики, АЭ тесносвязана со скоростью оседания эритроцитов (СОЭ), измерение которой широкоиспользуется в клинической диагностике [21,22].

АЭ, является главным процессом,определяющим СОЭ, но в отличие от СОЭ может быть измерена быстро и содержитбольше специфической диагностической информации. Таким образом, изучение АЭявляется перспективным для диагностики и мониторинга заболеваний.В настоящее время к физиологической роли АЭ относят её участие вследующих процессах:1) комплексная регулировка вязкости крови при низких сдвиговых скоростях[23,24]2) регулировка периферического гематокрита [2,5]3) локализация клеток крови относительно стенок сосудов [25]4) поддержание давления в кровеносных сосудах [26]Как один из примеров, на рисунке 1.2 показана локализация клеток крови,медленно протекающих через цилиндрическую трубку.

Наблюдается изменениераспределения клеток относительно стенок сосуда, образование маргинального слоя устенок трубки и большее или меньшее скопление клеток в приосевой части сосуда взависимости от степени АЭ.14Рис. 1.2. Фотография потока крови, протекающей со скоростью 3.3 мм/с через стекляннуютрубку диаметром 95 мкм: (а) бычья и (б) человеческая. В бычьей крови АЭ практически непроисходит, и образуется лишь тонкий маргинальный слой.

В человеческой крови происходитболее интенсивная АЭ, и наблюдается скопление клеток у оси трубки и образование болеетолстого маргинального слоя около стенок [17].1.1.3. Агрегация эритроцитов при патологииПри патологиях, включая большинство социально значимых заболеваний [5,27], такихкак сахарный диабет [28-33], гипертензия, серповидная анемия [34,35], сепсис [36],ишемия [37], сердечнососудистые заболевания [38], различных типов воспалений[39,40], и других заболевании [41] наблюдается усиленная АЭ.

Различия в параметрах,характеризующих АЭ при некоторых заболеваниях, представлены на рисунке 1.3. Припатологиях может возникать так называемый «гиперагрегационный синдром», прикотором эритроциты аномально быстро и прочно агрегируют. Изменение АЭ припатологиях связывают в основном с изменением концентрации белков плазмы крови и,в меньшей степени, с изменением свойств самих эритроцитов. Агрегация эритроцитовможетслужитьдиагностическим параметром дляпатологическихсостояний.Последствием усиленной агрегации являются в первую очередь закупориваниеучастков кровеносных сосудов, в которых должно было бы произойти сдвиговое15разрушение агрегатов, и тем самым возникает локальная ишемия, повышение давленияи пр.Рис.

1.3. Различие параметров M и M11, характеризующих агрегацию эритроцитов, для групп:контроль (Control), стабильная стенокардия (SA), нестабильная стенокардия (UA), острыйинфаркт миокарда (AMI) [38]. Наблюдается значительное усиление агрегации эритроцитов приналичии патологии.1.2. Факторы, изменяющие параметры агрегации эритроцитовИзвестно, что АЭ происходит только в наличии в окружающей их среде крупныхмакромолекул.

При этом степень АЭ определяется в основном двумя факторами:первый – это фактор среды, определяемый концентрацией и типом макромолекул;второй – это фактор клетки, определяемый склонностью клетки к образованиюагрегата [42,43].1M и M1 – это параметры, измеряемые с помощью агрегометра Myrenne. Они измеряются по изменениюинтенсивности лазерного излучения, рассеянного на суспензии образца крови. Образец помещается втонкий зазор между вращающимся конусом и пластиной. Сначала эритроциты полностьюдезагрегируются приложением сдвиговой скорости 600 с-1.