Отзыв официального оппонента 3 (Атомно-силовая микроскопия сигма(70)-субъединицы РНК-полимеразы E.coli)

отзыв официального оппонента Батищева Олега Вячеславовича на диссертационную работу Кузьминой Натальи Викторовны «Атомно-силовая микроскопия сигма(70)-субъединицы РНК-полимсразы Е.сой», представленной на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальностям 03.01.02 - «Биофизика»,03,01.08 - «Биоинженерия» Диссертационная работа Кузьминой Н,В, выполнена в русле одного из актуальных направлений современной биофизики и биоинженерии — изучение природы формирования амилоидных фибрилл из различных белков и полипептидов и поиск способов управления этим процессом, как для лечения различных заболеваний, так и для перспективных биотехнологических приложений.

В качестве основного объекта исследований в данной работе была выбрана сигма(70)-субъединица РНК-полимеразы Е.сой, играющая важную роль в процессе транскрипции генетического материала бактериальных клеток. Данный белок достаточно хорошо изучен с функциональной точки зрения, однако процесс его агрегации в различных условиях, морфология таких агрегатов, а также условия их перехода в амилоидные формы до сих пор оста«>тся невыясненными. Выявлению физико- химических основ этих процессов как раз и посвящена диссертационная работа Кузьминой Н,В. Для этого в работе исследована морфология агрегатов сигма(70)- субъединицы РНК-полимеразы Е,сой в зависимости от свойств среды и условий хранения препарата, изучены механические свойства таких агрегатов, а также исследованы различные мутанты данного белка е целью установления ключевых участков, ответственных за его агрегацию.

Кроме того, в работе была предложена модель формирования агрегатов сигма(70)-субъединица РНК-полимеразы Е.сой и выявлены условия, способствующие интенсификации данного процесса, В качестве основного метода в работе была выбрана атомно-силовая микроскопия, позволяющая получать информацию о структуре исследуемых объектов с нанометровым разрешением. Эти исследования были дополнены другими методиками, такими как электронная микроскопия, спектрометрия, молекулярная динамика и т.п., что позволило построить достаточно полную картину процесса агрегации исследуемого белка и его мутантных форм, Диссертационная работа представлена в традиционном стиле и изложена на 110 страницах, содержит 48 рисунков и 2 таблицы.

Она состоит из введения, 4 глав, результатов и выводов, списка сокращений и списка цитируемой литературы. Библиографический список включает 137 наименований. Вводная часть диссертации и обзор литературы достаточно аргументировано излагают выбор основного направления и объектов исследования, экспериментальных методов и способов анализа полученных результатов. Обзор литературы состоит из четырех разделов.

Первый раздел посвящен функциональной роли РНК-полимеразы в жизненном цикле прокариот, и, в частности, описанию структуры и функций сигма(70)- субъединицы РНК-полимеразы Есо1~. Во втором разделе рассматриваются механизмы агрегации белков, где основной акцент сделан на амилоидную агрегацию. Рассматриваются характерные особенности амилоидов, такие как специфическое взаимодействие с Конго красным, приводящее к смещению спектра поглощения данного красителя с 490 нм на 530-540 нм, специфическое связывание с тиофлавином Т, а также нерастворимость в большинстве растворителей и устойчивость к высоким температурам.

Приведены примеры белков, склонных к амнлоидной агрегации, возможные механизмы такой агрегации, а также связанные с этим процессом заболевания и возможные прикладные аспекты применения амилоидной агрегации в электронике и создании новых сверхпрочных материалов. В третьем разделе обзора литературы описываются методы исследования амилоидных структур, позволяющие получить достаточно высокое пространственное разрешение.

К таким методам относятся атомно-силовая микроскопия и просвечивающая электронная микроскопия. Описаны основные принципы работы данных методов, а также приведены примеры их применения для изучения амилоидных фибрилл, формируемых различными белками. Последний, четвертый раздел обзора литературы более подробно описывает применение метода атомно-силовой микроскопии для исследования процессов формирования амилоидных фибрилл.

Представлены описания исследований стадий агрегацин белков„разнообразия форм получаемых фибрилл и характерные особенности их строения. В целом, обзор литературы демонстрирует достаточную компетентность автора в данной области. В нем охвачены как основные методы, используемые для структурного анализа амилоидных фибрилл, так и ключевые особенности формирования подобных агрегатов, рассмотренные на примере многих различных белков. Показана значимость выбранного предмета исследований и необходимость получения более полной информации о физико-химических механизмах агрегации сигма(70)-субъединица РНК- полимеразы Е.сой для расширения представлений о классах возможных амилоидных белков.

Экспериментальная часть диссертации, основные результаты и их обсуждение разнесены по главам 2, 3 и 4. Глава 2 посвящена исследованию палочкообразной агрегации о70-субъединицы РНК-полнмеразы Е. со11 и содержит основную массу полученных экспериментальных данных. Показано, что при адсорбции на поверхности слюды данный белок может присутствовать как в виде мономеров, так и в виде различных агрегатов, в том числе палочкообразной формы. Путем подбора режима сканирования было установлено, что данные палочкообразные агрегаты представляют собой левозакрученную спираль, что соответствует хиральности описанных в литературе амилондных фибрилл.

Изучена зависимость процесса адсорбции исследуемого белка от ионной силы раствора и условий хранения исходного препарата. Показано, что повышение ионной силы раствора и наличие солей двухвалентный металлов повышает плотность адсорбционного слоя белка и долю палочкообразных агрегатов, в то время как длительное хранение образца практически не влияет на процесс формирования подобных агрегатов. В целом, представленные данные подтверждают гипотезу о склонности сигма(70)-субъединицы РНК-полимеразы Е.со11 к амилоидной агрегации в физиологических условиях.

Дальнейшие исследования взаимодействия данного белка с красителем Конго красный независимо показали наличие 13-структур в растворе белка, характерных для амилоидных агрегатов. Эксперименты по гель-электрофорезу показали, что длительное хранение образца белка приводит к формированию в нем аморфных агрегатов. Важной частью работы является исследование различных мутантов сигма(70)- субъединицы РНК-полимеразы Е.со11, что позволяет более точно установить участки белка, ответственные за амилоидную агрегацию. Для того, чтобы предложить модель агрегации амилоида сигма(70)-субъединицы РНК-полимеразы Е.

со11, исследовалась роль Х-концевого участка. С этой целью использовались мутантные образцы белка с делециями Л1-73 (Р1) (удалено 73 аминокислотных остатка от Х-конца), Л1-100 (132) (удалено 100 аминокнслотных остатков от Х-конца) и Л74-100 (134) «внутри удалено 26 аминокислотных остатков). Все три мутанта проявляли склонность к формированию палочкообразных агрегатов приблизительно равного диаметра, однако общее количество таких агрегатов сильно различалось. Наибольшая склонность к агрегации наблюдалась у мутанта Ш, близкая к ней — у мутанта 04. Автором делается вполне разумное предположение, что именно те участки нативного белка, которые были удалены в этих мутантах, и препятствовали более сильной амилоидной агрегации белка дикого типа. Важным элементом работы является проверка полученных результатов при сканировании на воздухе экспериментами в водных растворах, что позволяет исключить возможные артефакты, связанные с высушиванием белка.

Данные о размерах формируемых палочкообразных агрегатов нашли независимое подтверждение в экспериментах по просвечивающей электронной микроскопии, Третья глава посвящена исследованию червеобразных агрегатов сигма(70)- субъединицы РНК-полимеразы Е. сой„по-видимому„представляющих собой предшественников амилоидных фибрилл данного белка. Была изучена морфология таких структур. представляющих собой «бусины на нити». Для выявления роли обнаруженных червеобразных структур в формировании зрелых амилоидных фибрилл была проведена оценка механических свойств и сравнительный анализ с литературными данными протофибрилл других белков.

Были проанализированы персистентная длина червеобразных структур и их модуль Юнга в зависимости от ионной силы раствора. Характер зависимости персистентной длины от ионной силы отвечал поведению заряженных полимеров в растворе. Полученные значения модуля Юнга показали, что, несмотря на способность исследуемого белка к амилоидной агрегации, его протофибриллы значительно более гибкие, чем у других белков. Моделирование методами молекулярной динамики показало, что «бусины» на червеобразных структурах, наблюдаемые методом атомно-силовой микроскопии, скорее всего, представляют собой димеры исследуемого белка.

Оценки морфологии червеобразных структур, полученные по данным полн оатомного моделирования, находятся в хорошем соответствии с результатами экспериментов по атомно-силовой микроскопии. В последней, 4-й главе, предпринята попытка объяснить молекулярный механизм построения амилоидных фибрилл сигма(70)-субъединицы РНК-полимеразы Е. сой. Предложена модель так называемых "кофейных чашек", в которой "ручка" и "чаша'* соответствуют частично разупорядоченному участку и структурированной глобуле, соответственно. Данная модель подразумевает наличие внутри белка двух "самокомплементарных" участков, обеспечивающих самосборку белка. Эта модель объясняет как наличие димера в качестве основной структурной единицы, так и возможность формирования спиральных структур при замыкании цикла молекул белка.

В разделе «Заключение и выводы» сформулированы основные результаты работы, к которым относится как сам факт обнаружения амилоидной агрегации сигма(70)- субъединицы РНК-полимеразы Е. сой, так и объяснение молекулярного механизма этого процесса и результаты исследований его зависимости от ионной силы раствора и содержания двухвалентных катионов. В завершении сформулированы основные выводы диссертации. Резюмируя вышесказанное, можно вьщелить основные положительные качества диссертации, Работа выполнена на хорошем экспериментальном уровне с привлечением целого ряда достаточно сложных методов, таких как атомно-силовая микроскопия, электронная микроскопия, спектроскопия, молекулярная динамика и т.д.