Синтез мономеров полиамидных миметиков нуклеиновых кислот и исследование их свойств, страница 9

литературный обзор)невыгодно из-за низкого выхода на последующей стадии ацилирования, в случаеполучения цитозинсодержащих мономеров ОЗ ПНК (схема 1А) [6], а также ввидусклонности псевдопептидов к циклизации (в присутствии основания) с образованиемпроизводного пироглутаминовой кислоты (в случае α-мономеров ОЗ ПНК) и δ-лактама (вслучае γ-мономеров ОЗ ПНК) (схема 1В) [5, 97].Схема 1. Преимущества и недостатки различных путей синтеза мономеров ОЗ ПНК.BOOONBocHNBocHNOAllO-BzlOHBzlO-BzlOHOHNOO+BzlOOAllOHOAllB=T, 55%, 78%CCbz <10%ABocHN+OHNBBocHNOAllNOBOOONBocHNOBzlOAllONBocHNOBOAllOOBzlB=T,CCbz,ACbz,GOBzl,GOBzlNCbzBBBrOBzlOOBrOBocHNCNBocHNNOOAllOOAllOOBzlПоэтому в нашей лаборатории был разработан альтернативный путь синтеза,сочетающий в себе введение защитных групп в нуклеиновые основания (за исключением45тимина) и их последующее алкилирование бромпроизводными псевдопетидов (схема 1С)[6].Получение мономеров ОЗ ПНК состоит из 4-х этапов:1.

Получение защищенных гетероциклических оснований.2. Получение бромацетамидных производных псевдопептидов.3.Алкилированиегетероциклическихоснованийбромацетамиднымипроизводными псевдопептидов.4. Удаление С-концевой аллильной защиты.Вос/Cbz-Стратегия твердофазного синтеза подразумевает использование в качествеN-концевой защитной группы мономера ОЗ ПНК Вос-группу, на остаток глутаминовойкислоты вводят Bzl-защиту, а экзоциклические аминогруппы нуклеиновых основанийзащищают Cbz-группой, а С-конец мономера ортогонально защищают аллильнойфункцией. Для осуществления синтеза мономеров ОЗ ПНК по Boc-протоколутвердофазного синтеза, необходимо предварительно защитить функциональные группыгетероциклических оснований.Схема 2. Синтез Cbz-аденина.NH2NNNHCbzCbzCl, NaHNN0NHN10 CNH55%N2Для аденина 1 ранее была показана возможность введения Сbz-защиты наэкзоциклическую аминогруппу [6, 98] (схема 2).

Реакция аденина с CbzCl в присутствииNaH(2экв.)при0оСватмосфереArприводилакобразованиюN6-(бензилоксикарбонил)аденина 2, который очищали прекристаллизацией в системеCH3Cl/метанол (9:1) (схема 2). Выход реакции составил 55%, что выше чем предыдущиерезультаты (26% [6] и 48% [7]), принимая во внимание увеличение стартовой загрузки в15 раз, в первом случае, и в 3 раза, во втором. Присутствие в 1H-ЯМР спектре сигналовпротонов ароматической фенильной группы и протонов, соответствующих метиленовойгруппе Cbz-защиты, а также отсутствие сигналов NH2-группы аденина подтверждалоструктуру конечного продукта. Элементный состав определяли данными элементногоанализа.

Увеличение начальной загрузки аденина 1 в 15 раз приводило к увеличениювыхода реакции в 2 раза по сравнению с предыдущими результатами.46Схема 3. Синтез гуаниновых производных [99, 100].ONNHAOIbuClTEAoNHN3NH2BrN100 CNHNHOON4NOONNaH,ДМФАNHNHNONNHBNHN3(iPrCO)2O,ДМФАNH2150oCONNHNHN4ODpc1. Ac2O,ДМФАON2. DpcCl, NDIEA, HPyNHNH5OOOONN6OBrOtBuNaH,ДМФАNHONNHNNOOtBuONH7Получение производных гуанина является трудоемкой задачей ввиду его крайненизкой растворимости в органических растворителях, но все же ряд работ поиспользованиюгуанинавкачественачальногосубстратадляприготовлениягуанинсодержащих мономеров ПНК были опубликованы.

Так Uhlmann E. et al. в своейработе [99], по получению монометокситритил-защищенных мономеров (Mmt-мономеров)ПНК, синтезировали N2-изобутирилгуанин 4 из гуанина 3 (схема 3А), реакцией последнегос хлорангидридом изомасляной кислоты в присутствии TEA при температуре 100оС.Алкилирование метиловым эфиром бромуксусной кислоты приводило к образованиюсмеси N7-/N9-региоизомеров, N9-алкилированный гуанин 5 был отделен от региоизомераколоночной хроматографией, а выход N9-региоизомера составил 62%.ГруппавенгерскихисследователейподруководствомKovácsG.[100]первоначально вводили гуанин 3 в реакцию с диизопропилкарбонатом в ДМФА при 150оС(схема 3В). Дальнейшее ацетилирование N9-положения Ibu-гуанина уксусным ангидридомпри100оСиреакцияполучившегосяN2-изобутирил-N9-ацетилгуанинасN,N-дифенилкарбамоил хлоридом в присутствии DIEA в итоге приводили к образованию дизащищенного производного гуанина 6.

Использование второй защитной группы на О6положении гуанина должно было способствовать региоселективному прохождениюреакцииалкилированияметиловымэфиромбромуксуснойкислоты,новдействительности содержание N7-региоизомера составило 15% (выход N9-замещенногопродукта 7 составил 71%).

Тем самым можно предположить, что на региоселективность47реакции алкилирования гуанин-производных может оказывать влияние разветвленностьалкилирующего агента.Схема 4. Синтез Cbz-гуанина.OONCbzClTEANHNoNHN3NH2rt-60 CNHNHN8NHCbzВ нашем случае (схема 4) реакция гуанина с CbzCl в присутствии TEA в ДМФАпри комнатной температуре не показала желаемого результата, повышение температурыдо 60оС, также не способствовало протеканию реакции, при этом начиналосьдекарбоксилирование CbzCl, что согласуется с литературными данными [101].Схема 5. Синтез производных гуанина из 2-амино-6-хлорпурина [67, 98].OBnClClNANHBrCH2COOH, NK2CO3NNNNH29NNNONNH2AllBr,N K2CO3ДМФАNNH2NCbzIm,KH,NH 18-краун-6ТГФNNH2OBNH9NNNN1N HClNNH2NH2OHClNNO1110OHClNBzlONaONNNNHCbz141312NHO1.

O3, DCM, MeOH2. Me2SNN3. NaClO2, NaH2PO4,H2O, (CH3)3COOH,2-метил-2-бутен, ТГФNHNOOHNHCbz15Наиболее часто в качестве исходного соединения для синтеза гуанинсодержащихмономеровПНКиспользуют2-амино-6-хлорпурин,которыйимеетвысокуюрастворимость в органических растворителях по сравнению с гуанином. Так былиописаны пути получения карбоксиметилированных производных гуанина 11 и 15 (схема5), в первом случае в соединении 11 в качестве защитной группы экзоциклическогокислорода была выбрана бензильная группа [67], во втором случае производное 15 сосвободной кетогруппой гуанина, но с защищенной аминогруппой при помощи Сbzфункции [98]. При выборе стратегии со свободной аминогруппой гуанина в мономереПНК (схема 5А), надо учитывать, что при введении такого мономера в олигомерную цепь,необходимо исключить дальнейшее кэппирование непрореагировавших аминогрупп, из-за48возможности N2-ацилирования гуанинового производного уксусным ангидридом [67], вэтом случае необходимо повышать выход реакции конденсации между мономернымизвеньями, либо проводить повторные конденсации.

Обе стратегии использовалирегиоселективное алкилирование 2-амино-6-хлорпурина, в первом случае бромуксуснойкислотой в присутствии K2CO3 (схема 5А), а во втором, аллилбромидом, также вприсутствии K2CO3 (схема 5В). Последующее введение бензильной группы реакцией сбензилатом натрия в случае первой стратегии (схема 5А), и, кислотный гидролиз 2-амино6-хлор-9-аллилгуанина 12, с последующей реакцией полученного продукта 13 с Cbzимидазолом в присутствии гидрида калия и 18-краун-6 эфира, за которыми последовалиозонолиз и окисление, в случае второй стратегии (схема 5В), приводили к образованиюзащищенных карбоксиметилированных гуанинсодержащих производных 11 и 15.Схема 6.

Синтез защищенных производных гуанина для синтеза мономеров ОЗ ПНК.ClNOBnNNHNBzlOH, NaH NN060 CNH2 82%NH9N16OBnCbzCl, NaHN00C44%NHNH2NN17NHCbzТаким образом, можно сделать вывод, что для того чтобы алкилированиегуаниновых производных протекало с высокой региоселективностью, необходимо либопроводить алкилирование 2-амино-6-хлорпурина, либо ввести защитную группу в О6положение гуанина, а для уменьшения побочных процессов в твердофазном синтезеолигомеров ОЗ ПНК следует вводить защитную группу на экзоциклическую аминогруппугуанина.

Для получения мономеров ОЗ ПНК алкилирование 2-амино-6-хлорпурин споследующим кислотным гидролизом и введением защитных групп неприменимо, ввидунеустойчивостью защитных групп остова мономера.Поэтому, первоначально вводили бензильную группу в О6-положение гуанина,исходя из 2-амино-6-хлорпурина (схема 6). Был осуществлен ряд экспериментов длявыбора оптимальной синтетической процедуры получения O6-бензилгуанина 16 (табл. 1).Таблица 1. Способы синтеза О6-бензилгуанина, опробованные в работе.условияВыход, %Ссылка1BzlOH, NaH, 1,4-диоксан, 100oC27[102]2BzlOH (изб.), NaH, 130oC43[103, 7]3BzlOH (изб.), NaH, 65oC62[104]В первом случае, аналогично с работой [102], при действии бензилатом натрия на2-амино-6-хлорпурин в 1,4-диоксане при 100оC, с последующим выделением O6бензилгуанина 16 при помощи колоночной хроматографии, выход продукта оказался 27%.49Во втором эксперименте [103, 7], реакцию проводили в избытке бензилового спирта при130оС, после обработки и перекристаллизации из воды выход составил 43%, но трудностис удалением бензилового спирта в ходе обработки реакции и средний выход заставили насискать иной подход.

Наилучшие результаты показал способ, ранее описанный немецкимихимиками [104], в этом случае, реакцию проводили также в избытке бензилового спирта,но температурный режим был уменьшен до 65оС, ввиду побочного процессаалкилирования экзоциклической аминогруппы, протекающего при температуре 120130оС. Экстракция 2M NaOH и последующая нейтрализация водной фазы позволиливыделить целевой продукт 16.

Выход составил 62%. Структуру и чистоту подтверждали1Н-,13С-ЯМР-спектроскопией (в спектрах присутствовали сигналы фенильной иметиленовой групп бензильной защиты), элементный состав подтверждали массспектрометрией высокого разрешения и элементным анализом.Далее вводили Cbz-защиту на аминогруппу гуанина. Ранее Dueholm K. L. et al. [67]пытались ввести Cbz-функцию, действуя на 2-амино-6-хлорпурин реагентом Раппопорта,но желаемый продукт в этом случае не образовывался, реакция же CbzCl приводила ксложной смеси продуктов, для разделения которой было невозможно подобратьхроматографические условия. Thomson S. A. et al. [98], как было описано выше, вводилиCbz-защиту, действуя на 2-амино-6-хлор-9-аллилгуанин Cbz-имидазолом.

В нашем случаереакция О6-бензилгуанина 16 с Cbz-имидазолом, не показала желаемого результата.Поэтому мы провели реакцию О6-безилгуанина 16 с CbzCl в присутствии гидрида натрия,согласно с ранее разработанной нами методикой [7] (схема 6). Продукт 17 выделяли припомощи колоночной хроматографии, выход реакции составил 44%. В результате былополучено ди-защищенное производное гуанина 17.