Синтез мономеров полиамидных миметиков нуклеиновых кислот и исследование их свойств, страница 12

В результатеконденсации был получен целевой димер 59 (схема 14). Структуру соединений 47-59подтверждали данными1Н-,13С-ЯМР-спектроскопии, чистоту оценивали даннымиэлементного анализа.63Схема 14. Получение димера хиральных ПНК на основе L-Ala.TOONBocHNO57oTFA, m-крезол, 0 CTTOOONBocHN+H3NCF3COO-OH56TN58TOBocHNO29%IBCF, NMM, TEAONOONHNOO59Для установления направления преорганизации димера 59 необходимо найти в 1НЯМР спектре сигналы, соответствующие метиленовым протонам 4 и 5 (рис. 10).

Дляопределения химических сдвигов этих протонов была использована двумерная ЯМРспектроскопия.Рисунок 10. Структура хиральной части димера 33.Расшифровка одномерного 1Н-ЯМР спектра является трудоемкой задачей, из-заналичия ротамерных форм структуры димера 59, которое обусловлено затрудненнымвращением вокруг амидных связей (рис. 11), что способствует увеличению количествасигналов в четыре раза. Поэтому для получения подробной картины был использованCOSY-метод двумерной ЯМР-спектроскопии с двухквантовой фильтрацией (DQF).64TTOBocHNNOONNHOOTAOTOBocHNBocHNTOONNHTNOONNHONOBOOTCOBocHNOONTNHONODРисунок 11.

Структуры ротамеров хирального димера 59.ВходеанализаCOSY(DQF)-спектрабылаиспользованаследующаяпоследовательность расшифровки сигналов: в начале были обнаружены кросс-пики междупротонами метильной группы аланина 1 (рис. 11) и протоном из метиленовой частиспектра, который соответствует протону 2 атома аланина (рис. 12) (ввиду большого числасоседних протонов и наличия заторможенных конформаций димера сигнал отображалсябольшим числом мультиплетов), далее были обнаружены корреляции между протоном 2 ипротоном аминогруппы 3 (рис. 13), а также корреляция с протонами из метиленовой частиспектра, которая соответствует протонам 4 и 5 (рис. 14).Рисунок 12. Фрагмент COSY(DQF)-спектра димера 59.65Рисунок 13.

Фрагмент COSY(DQF)-спектра димера 59.Рисунок 14. Фрагмент COSY(DQF)-спектра димера 59.Таким образом были установлены химические сдвиги, отвечающие протонам Н4 иН5 (рис. 10), данные представлены в таблице 3.Таблица 3. Химические сдвиги протонов 4 и 5.66H412343.635-3.561 м.д.3.722-3.679 м.д.3.797-3.751 м.д.3.875-3.810 м.д.(dd, JH4H5=14.7(dd, JH4H5=14.5(dd, JH4H5=13.8(dd, JH4H5=14.6Гц, JH2H4=10.9Гц, JH2H4=8.5Гц, JH2H4=9.5Гц, JH2H4=9.2Гц)Гц)Гц)Гц)3.208-3.162 м.д.H5(dd, JH4H5=13.9Гц, JH2H5=4 Гц)3.329-3.277 м.д.(dd, JH4H5=14.1Гц, JH2H5=4.1Гц)3.388-3.342 м.д.(dd, JH4H5=14.8Гц, JH2H5=4 Гц)3.493-3.441 м.д.(dd, JH4H5=15.1Гц, JH2H5=4.2Гц)Для определения преорганизации молекулы димера 59 было использованоуравнение Карплуса (J(φ)=Acos2φ+Bcosφ+C, где A, B, C-эмпирические коэффициенты),которое на основе двугранных углов в молекуле дает значения констант спин-спиновоговзаимодействия.

Принимая во внимание, что ранее методами рентген-структурногоанализа и компьютерным моделированием было установлено, что для правозакрученныхпреорганизованных молекул γ-ПНК двугранный угол составляет +60о (рис. 15) (длялевозакрученных спиралей ─ -60о) [79], то можно сделать вывод, что геминальныеконстанты спин-спинового взаимодействия протонов Н4 и Н5 для обоих видовпреорганизации равны JH4H5=15 Гц, вицинальные константы между протонами Н2 и Н4 ─JH2H4=11 Гц, а вицинальные константы спин-спинового взаимодействия между протонамиН2 и Н5 в случае правозакрученной преорганизации ─ JH2H5=4 Гц, а в случаелевозакрученной преорганизации ─ JH2H5=2 Гц.Рисунок 15. Проекции Ньюмана для право- и левозакрученных хиральных ПНК.В нашем случае, константы спин-спинового взаимодействия для различныхротамерных структур (усредненные значения) составили JH4H5=14.4 Гц, JH2H4=9.5 Гц иJH2H5=4.1 Гц.

Вицинальные константы спин-спинового взаимодействия между протонамиН2 и Н5 равная 4.1 Гц (рис. 16) свидетельствовали о том, что димер 59 принимаетправозакрученную конформацию.6715.1 Гц4.1 Гц4.1 ГцРисунок 16. Фрагмент 1Н-ЯМР спектра димера 59.Таким образом, наличие метильной группы в γ-положение ПНК преорганизуетструктуру в правозакрученную спираль, что может быть доказано при помощи 2D-ЯМРспектроскопии.Дляосуществленияданногоанализавыгодноиспользоватьдейтерированную модификацию димеров для уменьшения перекрывающихся сигналов в1Н-ЯМР-спектре.Исследование биологической активности полученыхгуанинсодержащих производных.Как известно, гуаниновые производные являются широко используемыми агентамив терапии онкологических заболеваний.

Так O6-бензилгуанин 16 используется, какингибитор действия алкилтрансферазы, уменьшая токсичность противоопухолевыхагентов [114], а N2-замещенные аналоги пурина являются ингибиторами протеинкиназнойактивности [115]. Поэтому с целью выявления потенциальной биологической активностигуаниновых производных 17, 27a было проведено исследование ингибированияактивности фермента топоизомеразы I полученными веществами. В качестве образцасравнения использовали О6-бензилгуанин 16, известный как ингибитор этого фермента[116] (рис. 17).68мкМРисунок 17.

Электрофореграмма продуктов реакции релаксации суперскрученной ДНК(ДНКсс) под действием топоизомеразы I (Топо I) в присутствии соединения 16.ЭлектрофорезпродуктоввзаимодействияДНКссстопоизомеразойIвприсутствии/отсутствии соединений 17 и 27a показал, что в отличие от 16 (рис. 16),данные соединения не ингибируют тестируемый фермент (рис. 17).1727аРисунок 18. Электрофореграмма продуктов реакции релаксации ДНКсс поддействием Топо I в присутствии соединений 17 и 27a.Таким образом, дизащищенное производное гуанина 7 и монозащищенныймономер 14а не являются ингибиторами действия топоизомеразы I, по-видимому, этоможет быть обусловлено тем, что закрытые N2 и N9-положения гуанина уменьшаютаффинность связывания с ДНК, тем самым не создавая препятствие для действиятопоизомеразы I.69Экспериментальная частьВ работе использовали следующие реактивы:Германия),CbzlCl(Merck,Германия),N-метилморфолин (Aldrich,[Pd(PPh3)4](Aldrich,Германия),изобутилхлорформиат (Aldrich, Германия), тиофенол (Aldrich, Германия), тимин (Acros,Бельгия), аденин (Acros, Бельгия), 2-амино-6-хлорпурин (Acros, Бельгия), DEAD (40%раствор в толуоле) (Fluka, Швейцария), PPh3 (Merck, Германия), N-этиланилин (Aldrich,Германия), морфолин (Aldrich, Германия), бромацетил бромид (Aldrich, Германия), дитрет-бутилпирокарбонат(Lancaster,Великобритания),NsCl(Aldrich,Германия),тионилхлорид (Aldrich, Германия); реактивы марки х.ч и ч.д.а.

отечественногопроизводства: бензиловый спирт, уксусная кислота, триэтиламин, ТГФ, ДМФА, метанол,этанол, хлористый метилен, этилацетат, гексан, 1,4-диоксан, ацетонитрил, диэтиловыйэфир, P2O5, KOH, NaOH, LiAlH4, гидрокарбонат натрия, хлорид натрия, сульфат натрия,гидрид натрия, гидрид кальция, оксид бария, карбонат калия, лимонная кислота.Следующие растворители были очищены перед использованием: бензиловый спирт(перегоняли в высоком вакууме), хлористый метилен (перегоняли над P2O5), ДМФА(перегоняли над фталиевым ангидридом в вакууме), тетрагидрофуран (перегоняли надКОН и непосредственно перед реакциями над LiAlH4), ацетонитрил (кипятили над P2O5 втечение 2 ч. с последующей перегонкой), триэтиламин (перегоняли над KOH и СаН2), Nметилморфолин (кипятили над BaO и затем перегоняли), 1,4-диоксан (кипятили над Na изатем перегоняли).1Н-ЯМР-спектрыполученныхсоединенийрегистрировалипри25Сoнаимпульсных Фурье-спектрометрах Bruker DPX-300 (Германия) и Bruker DPX-600(Германия), рабочая частота указана в описании спектральных данных.

Химическиесдвигиприведенывмиллионныхдоляхотносительновнутреннегостандартатетраметилсилана ( 0.000 м.д.). Константы спин-спинового взаимодействия (J)приведены в Гц. При описании 1Н-ЯМР-спектров приняты следующие сокращения: s синглет, d - дублет, t - триплет, dd - двойной дублет, q - квартет, m - мультиплет. Спектрырегистрировали в CDCl3, ДМСО-d6 или ацетоне-d6.Масс-спектры высокого разрешения регистрировали на приборе micrOTOF-Q II(Bruker Daltonics GmbH, Германия). Значения оптических углов вращения были измерены,используя поляриметр AA-55 (Optical Activity Ltd, Соединенное Королевство).

Значениятемпературы плавления были измерены, используя Carl Zeiss микроскоп.Колоночную хроматографию проводили на сорбенте Silica gel 60 (0.040-0.063 мм)(Merck, Германия).70Протекание реакций контролировали с помощью ТСХ на пластинках Silica gel 60F254 (Merck, Германия).Вещества на пластинках обнаруживали в УФ-свете (254 нм) и опрыскиванием 0.5%раствором нингидрина в этаноле, либо в комплексе молибденовой кислоты и сульфатацерия (IV) с последующим нагреванием.Растворители, за исключением ДМФА, удаляли на ротационном вакуумномиспарителе (14 мм рт.

ст.). Вещества сушили в высоком вакууме масляного насоса (0.5 ммрт. ст.). ДМФА удаляли на ротационном испарителе при вакууме 0.5 мм рт. ст.Синтез защищенных гетероциклических основанийN6-(Бензилоксикарбонил)аденин (2).Дисперсию NaH (15.0 г, 45.0 ммоль) вминеральном масле промывали гексаном, добавляли 125 мл абсолютного ДМФА иохлаждали до 0oC. Порциями вносили аденин (15.0 г, 111.0 ммоль).