Синтез мономеров полиамидных миметиков нуклеиновых кислот и исследование их свойств, страница 16

Rf 0.48(гексан/этилацетат, 1:1); 1Н-ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 5.12 (s, br, 1H, -NH), 2.93 (s, 1H, OH), 1.43 (s, 9H, Boc(tBu)-); 13С-ЯМР (CDCl3, 75 МГц) δ 156.8, 80.4, 79.6, 28.4.Метиловыйэфир[N-(трет-бутилоксикарбонил)-2D2-аминоэтил]-N-(о-нитробензосульфонил)-D2-глицина (52). К охлажденному до 0оС раствору 51 (830 мг,5.06 ммоль), 50 (1.33 г, 4.82 ммоль) и PPh3 (1.53 г, 5.78 ммоль) в 70 мл THF в атмосфере Arдобавляли по каплям DEAD (40% раствор в толуоле) (2.8 мл, 5.78 ммоль).

Реакционнуюмассу перемешивали при комнатной температуре в течении 12 ч. Растворитель удаляли,полученное масло сушили в вакууме масляного насоса, растворяли в 50 мл диэтиловогоэфира и выдерживали 12 ч при 4оС. Выпавший осадок отфильтровывали, промывалидиэтиловым эфиром, фильтрат упаривали. Продукт выделяли при помощи колоночнойхроматографии (элюент: хлористый метилен/метанол 50:1), растворитель удаляли ипродукт сушили в вакууме (0.5 мм рт. ст.). Выход 1.68 г, кристаллы желтого цвета (83%).Rf 0.54 (гексан/этилацетат, 1:1); 1Н-ЯМР (ДМСО-d6, 300 МГц) δ 8.07-8.00 (m, 1H, -SPh),7.75-7.56 (m, 3H, -Ph(Ns)), 5.18-4.96 (d, J=39.8, 1H, BocNH-), 3.50 (d, J=5.3, 3H, -OMe), 1.42(s, 9H, Boc(tBu)-);13С-ЯМР (ДМСО-d6, 75 МГц) δ 169.5, 156.1, 147.9, 133.8, 132.9, 131.8,131.0, 124.2, 79.6, 52.4, 48.1, 37.7, 28.3.Метиловый эфир [N-(трет-бутилоксикарбонил)-2D2-аминоэтил]-D2-глицина (53). Краствору 52 (1.64 г, 3.89 ммоль) в 50 мл ацетонитрила при интенсивном перемешивании иохлаждении до 0оС добавляли карбонат калия (1.07 г, 7.77 ммоль) и тиофенол (1.2 мл,8311.66 ммоль).

Через 15 минут охлаждение убирали и перемешивали смесь в течение 12 чпри комнатной температуре. Растворитель удаляли, остаток растворяли в 40 млдиэтилового эфира и промывали 20% раствором лимонной кислоты (520 мл). Водныйслой промывали диэтиловым эфиром (115 мл), доводили до рН 6 добавлением карбонатакалия и экстрагировали хлористым метиленом (330 мл). Органическую фазу сушили надNa2SO4, растворитель удаляли. Продукт сушили в вакууме (0.5 мм рт.

ст.). Выход 860 мг,масло желтого цвета (93 %). Rf 0.13 (гексан/этилацетат, 1:1); 1Н-ЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ7.31 (s, br, 1H, -NH), 5.19 (s, br, 1H, BocNH-), 3.67 (s, 3H, -CH3), 1.38 (s, 9H, Boc(tBu)-); 13СЯМР (CDCl3, 75 МГц) δ 172.8, 156.1, 80.4, 79.6, 61.9, 51.7, 28.3, 14.4.Метиловый эфир N-[2-(трет-бутилоксикарбонил)-2D2-аминоэтил]-N-бромацетил-D2глицина (54). К раствору 53 (400 мг, 1.68 ммоль) в DCM (50 мл) добавляли бромацетилбромид (0.2 мл, 2.02 ммоль) при охлаждении до 0оС.

После этого добавляли TEA (0.3 мл,2.02 ммоль) по каплям и смесь перемешивали в течение 1 ч. Растворитель удаляли,остаток растворяли в этилацетате (50 мл) и последовательно промывали водой (225 мл) инасыщенным раствором NaCl (225 мл). Органическую фазу сушили над Na2SO4,растворитель удаляли. Продукт выделяли при помощи колоночной хроматографии(элюент: гексан/этилацетат, 2:3), растворитель удаляли и продукт сушили в вакууме (0.5мм рт. ст.). Выход 380 мг, масло желтого цвета (63%). Rf 0.28 (гексан/этилацетат, 1:1); 1НЯМР (CDCl3, 300 МГц) δ 5.41 (s, br, 1H, BocNH-), 3.91 (s, 2H, -CH2), 3.81-3.70 (d, J=11.3 Гц,3H, -СН3), 1.53-1.34 (d, J=3.7 Гц, 9H, Boc(tBu)-);13С-ЯМР (CDCl3, 75 МГц) δ 170.2, 169.5,167.8, 156.0, 79.9, 79.4, 62.2, 52.8, 52.5, 49.5, 48.7, 28.3, 14.4.Метиловый эфир N-[2-(трет-бутилоксикарбонил)-2D2-аминоэтил]-N-[тимин-1-илацетил]-D2-глицина (55).

К суспензии тимина (232 мг, 1.84 ммоль) в 15 млсвежеперегнанного ДМФА при механическом перемешивании добавляли предварительновысушенный карбонат калия (254 мг, 1.84 ммоль). Реакционную смесь перемешивали 15мин при комнатной температуре, после чего прибавляли раствор 54 (330 мг, 0.92 ммоль) в15 мл ДМФА.

Через 12 ч. растворитель удаляли при пониженном давлении, остатокрастворяли в воде (50 мл) и экстрагировали хлороформом (325 мл). Органическую фазусушили над Na2SO4, растворитель удаляли. Продукт сушили в вакууме (0.5 мм рт. ст.).Выход 262 мг, кристаллы белого цвета (71%). Rf 0.57 (этилацетат); 1Н-ЯМР (ДМСО-d6,300 МГц) δ 11.34-11.22 (d, J=3.4 Гц, 1H, ThyNH-), 7.36-7.19 (dd, J1=11.5 Гц, J2=9.2 Гц, 1H,C6HThy), 6.94-6.67 (d, J=59.5 Гц, BocNH-), 4.69-4.43 (d, J=52.5 Гц, 2H, -CH2), 3.73-3.59 (d,J=27.3 Гц, 3H, -СН3), 1.78-1.69 (m, 3H, -CH3Thy), 1.42-1.34 (d, J=2.3 Гц, 9H, Boc(tBu)-); 13СЯМР (ДМСО-d6, 75 МГц) δ 170.3, 170.0, 168.1, 167.8, 164.8, 156.2, 151.4, 142.4, 108.6, 78.5,78.2, 60.2, 52.7, 52.2, 48.2, 48.0, 28.6, 14.5, 12.4.84N-[2-(трет-бутилоксикарбонил)-2D2-аминоэтил]-N-[тимин-1-ил-ацетил]-D2-глицин(56).

К суспензии 55 (229 мг, 0.57 ммоль) в смеси ТГФ/вода (8:1; 22.5 мл) добавляли 2.3 мл2М раствора NaOH при охлаждении до 0оС. Через 15 мин температуру доводили докомнатной и смесь перемешивали в течение 45 мин. После этого раствор доводили до рН6 добавлением 0.1 M раствора KHSO4. Воду упаривали, к остатку добавляли 50 млметанола, осадок отфильтровывали. Фильтрат сушили над Na2SO4, растворитель удаляли.Продукт сушили в вакууме (0.5 мм рт.

ст.). Выход 221 мг (количественный), кристаллыбелого цвета. Rf 0.30 (DCM/метанол/уксусная кислота, 9:1:0.1); 1Н-ЯМР (ДМСО-d6, 300МГц) δ 11.27 (s, br, 1H, ThyNH-), 7.41-7.19 (m, 1H, C6HThy), 6.92-6.70 (d, J=53.7 Гц,BocNH-), 4.70-4.40 (m, 2H, -CH2), 1.79-1.67 (m, 3H, -CH3Thy), 1.45-1.06 (d, J=80.0 Гц, 9H,Boc(tBu)-);13С-ЯМР (ДМСО-d6, 75 МГц) δ 171.9, 171.4, 170.0, 168.9, 168.0, 167.7, 167.6,165.4, 164.8, 156.2, 151.9, 151.5, 142.6, 138.2, 108.5, 108.1, 78.5, 67.4, 51.3, 49.0, 48.2, 48.0,28.6, 12.4.

C13H11N5O2 Вычислено: %: C 57.99, H 4.12, N 26.01 C/N 2.23, Найдено: % C56.48, H 4.13, N 25.36 C/N 2.22.МетиловыйэфирN-[(трифторацетат)-(S)-2-метиламинопропил]-N-[тимин-1-ил-ацетил]-глицина (58). К охлажденному до 0оС раствору 57 (220 мг, 0.51 ммоль) в 30 млDCM, прибавляли м-крезол (0.5 мл) и трифторуксусную кислоту (5 мл). Через 2 чрастворитель удаляли, остаток переупаривали с толуолом (320 мл) и диэтиловым эфиром(320 мл).

Полученное масло сушили в вакууме (0.5 мм рт. ст.). Выход 226 мг, кристаллыбелого цвета (количественный). Rf 0.43 (гексан/этилацетат, 1:1); 1Н-ЯМР (CDCl3, 300 МГц)δ 11.32 (s, 1H, ThyNH-), 7.83 (s, br, 1H, -NH2) 7.44-7.24 (dd, J1=27.4 Гц, J2=25.2 Гц, 1H,C6HThy), 6.62-6.49 (m, 1H, BocNH-), 4.75-3.98 (m, 4H, (-CH2N)2), 3.77-3.60 (d, J=24.73 Гц,3H, -СН3), 3.57-3.38 (m, 1H, BocNHCHCH2-), 1.83-1.69 (m, 3H, -CH3Thy), 1.30-0.99 (m, 3H,CH3-).Метиловый эфир N-[(трет-бутилоксикарбонил)-2D2-аминоэтил]-N-[(тимин-1-илацетил)-N-[D2-ацетил]-N-[(S)-2-метиламинопропил]-[N-(тимин-1-ил-ацетил)]глицина (59). К охлажденному до -20оС раствору 56 (50 мг, 0.13 ммоль) и Nметилморфолина (0.03 мл, 0.26 ммоль) в 5 мл свежеперегнанного ДМФА в атмосфереаргона добавляли изобутилхлорформиат (0.02 мл, 0.13 ммоль). Через 3 мин добавлялиохлажденный до -20оС раствор 58 (67.35 мг, 0.15 ммоль) в 5 мл ДМФА.

Реакционнуюмассу перемешивали 30 мин при -20oС, а затем 1 ч при комнатной температуре.Растворитель удаляли. К остатку добавляли 20 мл метанола, осадок отфильтровывали.Фильтрат сушили над Na2SO4, растворитель удаляли. Продукт выделяли при помощиколоночной хроматографии (элюент: хлористый метилен/метанол, 4:1), растворительудаляли и продукт сушили в вакууме (0.5 мм рт. ст.).

Выход: 25 мг, кристаллы белого85цвета (29%). Rf 0.63 (DCM/метанол, 4:1); 1Н-ЯМР (ацетон-d6, 600 MГц) δ 10.17 (s, br, 2H, 2NH(Thy)), 7.49-7.38 (d, J = 36.1 Гц, 2H, 2C6Thy), 7.34-7.11 (m, 1H, NHC=O амид), 6.456.02 (dd, J1 = 181.0 Гц, J2 = 50.8 Гц, 1H, BocNH-), 4.90-3.98 (m, 8H, 8-CH2N-), 3.51-3.46(minor) (dd, J1 = 15.1 Гц, J2 = 4.2 Гц), 3.45-3.39 (major) (dd, J1 = 15.1 Гц, J2 = 7.0 Гц, 1H,BocNHCH-), 1.86-1.76 (m, 6H, 2-CH3Thy), 1.50-1.39 (d, J = 13.0 Гц, 9H, Boc(tBu)-), 1.331.10 (m, 3H, -CH3Ala); C16H18D6N4O7 Вычислено: % C 49.22, H 7.74, N 14.35, C/N 3.43,Найдено: % C 46.13, H 7.88, N 13.26, C/N 3.48.Биологические испытанияСпособность соединений 16, 17 и 27a ингибировать активность топо I in vitroопределялась в испытаниях ДНК релаксации.

Кратко, реакционная смесь (20 мкл),содержащую 1-2 ед.акт. Топо I (Promega, USA), инкубировали с 205 нГ суперскрученнойплазмидной ДНК pBR322 (Fermentas, Lithuania) в реакционном буфере (35 мМ Трис-НСl,pH 8.0, 72 мM KCl; 5 мM MgCl2; 5 мM дитиотрейтола; 2 мM спермидина, 100 мг/млбычьего сывороточного альбумина) (все реактивы фирмы «Sigma», USA) в присутствии0,1% ДМСО (контроль растворителя, данные не показаны) и исследуемых соединений при37оС в течение 30 мин. Реакция была остановлена добавлением додецилсульфата натрия(до 1 %).

После добавления протеиназы К (конечная концентрация 50 мг/мл) реакционнуюсмесь инкубировали 30-40 минут при 37оС. ДНК-топоизомеры разделяли методомэлектрофореза в 1%-ном агарозном геле (3 часа, 60 В) в буфере, содержащем 40 мМ Трисоснования, 1 мМ ЭДТА, 30 мМ ледяной уксусной кислоты, после добавления (1:10)буфера для нанесения (0.25 % бромфенол синего, 50 % глицерина).

Гели окрашивалибромистым этидием после проведения электрофореза и визуализировали в УФ-свете.86Выводы.1. Разработан региоселективный метод синтеза пуринсодержащих мономеров ОЗПНК. Впервые получены 3 гуанинсодержащих и 1 аденинсодержащий мономерыОЗ ПНК2. ДаннымидвумернойЯМР-спектроскопии подтверждена региоселективностьалкилирования пуринсодержащих гетероциклов.3. Прямым методом определения оптической чистоты с использованием ВЭЖХ напримере тиминсодержащих мономеров показана высокая энантиомерная чистотамономеров ОЗ ПНК4. Осуществлен синтез модельного димера на основе дейтерированного глицина.Показана правозакрученная преорганизация структуры димера при помощиметодов 2D-спектроскопии ЯМР5. Исследовано действие гуаниновых производных на активность топоизомеразы I87Список литературы1.Nielsen P.