Заключение организации (Прогнозирование метаболитов рилизинг-пептидов гормона роста в организме человека для разработки методики их определения в целях антидопингового контроля)

ректор,„'ФГБУ АДЦ, к,х н, Дикунец М.А. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Федерального государственного бюджетного учреждения «Антидопинговый центр» по диссертации Зверевой Ирины Олеговны на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности 02.00.10 — «Биоорганическая химия», 02.00.02 — «Аналитическая химия» Диссертация «Прогнозирование мегаболитов рилизинг-пептидов гормона роста в организме человека для разработки методики их определения в целях антидопингового контроля» выполнена на базе Федерального государственного бюджетного учреждения «Антидопинговый центр» 1ФГБУ АДЦ). В период подготовки диссертации соискатель Зверева Ирина Олеговна работала в ФГБУ АДЦ в должности инженера-исследователя, младшего научного сотрудника и научного сотрудника отдела пептидного допинга и анализа крови 1ПДиАК), затем — в должности научного сотрудника отдела хромато-массспектрометрических методов анализа (ХМСМА). В 2013 г.

Зверева И.О. с отличием окончила специалитет кафедры «Биоорганическая химия» биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова по специальности «Биохимия». Справка о сдаче кандидатских экзаменов выдана соискателю в 2017 г. ФГБОУ ВО «Московский технологический университет». Научные руководители — Кротов Григорий Иванович, кандидат биологических наук, научный сотрудник ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Ефимова Юлия Александровна, кандидат химических наук, доцент кафедры аналитической химии им. И.П.

Алимарина института тонких химических технологий (МИТХТ) Московского технологического университета. Обсуждение диссертации Зверевой И.О. проводилось 19 апреля 2017 года на базе ФГБУ АДЦ. На заседании присутствовали: директор ФГБУ АДЦ, к.х.н. Дикунец М.А., заместитель директора по менеджменту и контролю качества Мочалова Е.С., начальник отдела ХМСМА Дудко Г.А., начальник отдела ПдиАК, к.б.н. Никитина М.П., заместитель начальника отдела ПдиАК Постников П.В., заместитель начальника отдела РиХП, к.т.н.

Косарев К.Л., ведущий научный сотрудник отдела ХМСМА к.х.н Раков Д.В., старший научный сотрудник отдела ХМСМА, к.х.н. Бочкарева Н.Л., научный сотрудник отдела ПдиАК, к.б.н. Якунина Н,Ю., старший научный сотрудник Подольский И.И., старший научный сотрудник Савельева Н.Б., научный сотрудник Чуловская А.Л., инженер по качеству Рыбалкина С.В., менеджер по персоналу Кочергина Т.П., ученый секретарь Московского технологического университета, доцент кафедры аналитической химии им, И,П. Алимарина, к.х.н. Ефимова Ю.А., научный сотрудник ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, к.б.н. Кротов Г.И.

Слушали: 1. Доклад Зверевой И.О. по кандидатской диссертации «Прогнозирование метаболитов рилизинг-пептидов гормона роста в организме человека для разработки методики их определения в целях антидопингового контроля». 2. Сообщение научных руководителей диссертационной работы кандидата химических наук, доцента Ефимовой Ю,А. и кандидата биологических наук Кротова Г.И., давших характеристику соискателя. В ходе обсуждения диссертационной работы Зверевой И.О.

были заданы следующие вопросы и получены развернутые ответы: Вопрос к.б.н. Никитиной М.П.: 1) Почему для прогнозирования метаболитов ОНКР были выбраны именно зти модельные системы 1л лй.о? Ответ: Ферменты выбирали на основе предположений о вероятности их вовлеченности в процессы деградации изучаемых веществ, а также исходя из субстратной специфичности и тканевой локализации. При выборе остальных моделей т п1го опирались на литературные данные. Трансформация биоактивных веществ описана в разных органах организма: почках„коже, легких и кишечнике, среди которых печень считается центральным биотрансформируюшим органом, особенно для низкомолекулярных соединений с молекулярной массой <1-2 кДа.

Однако деградация пептидных соединений свойственна в основном в почках и крови. Человеческие субклеточные фракции печени и почек, гепатоциты наиболее 2 часто используются для изучения процессов абсорбции, распределения, метаболизма и выведения различных соединений и являются коммерчески доступными. Гепатоциты представляют собой очень капризную модельную систему, требующую специальные условия при хранении и обращении, поэтому были выбраны микросомы печени и почек человека, а также К9 фракция, содержащая метаболические ферменты как микросомальной, так и цитозольной фракций. Сыворотка крови использовалась как наиболее легко доступный набор протеолитических ферментов.

Вопрос к.т.н. Косарева К.Л.: 1) При разработке и валидации методики какими документами Вы руководствовались? Ответ: Помимо Международного стандарта ВАДА для лабораторий и ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 при разработке и валидации методики руководствовались Техническим документом ВАДА ТР20151РСК, регламентирующим минимальные критерии хромато-масс-спектрометрического подтверждения идентичности веществ в долин гово м контроле, и Техническим документом ВАДА ТР2015МКР1., указывающим минимально требуемые уровни определения для детектирования и идентификации непороговых субстанций, Вопросы к х.н. Ракова Д.В.. 1) Вопрос о протекании реакции деамидирования или деаминирования обсуждался ранее в литературных источниках, и какие методы при этом использовали авторы? Ответ: Впервые вопрос о необходимости доказательства процесса деамидирования был поднят в работе немецкой антидопинговой лаборатории.

Авторами предложено доказательство на основании разницы интенсивности сигнала при ионизации в положительном и отрицательном режимах сканирования двух пентапептидов с ХН - и ОН-группами на С вЂ” конце, а также использовании рекомбинантной амидазы для оценки скорости образования деамидированных метаболитов 2) С какой ошибкой определения соотношения и/а вы идентифицировали представленные на слайде соединения (слайд 11)? Ответ: Одним из критериев соответствия при идентификации ОНК.Р и их метаболитов была точность определения масс 1не более 5 ррпт).

Вопросы к.х.н. Бочкаревой Н.Л.: 1) Какое количество проб Вы анализировали для определения каждого нз метрологических параметров? Ответ: За исключением оценки специфичности, эксперименты по определению каждого из метрологических параметров проводились при анализе 6 проб. 11ри оценке специфичности анализировали 10 образцов мочи волонтеров. 2) Почему при анализе проб мочи после приема бНЙУ-1 волонтером в образцах мочи вы не детектировали исходное соединение". Связано ли это с низкой чувствительностью метода? Ответ: ОНА-1 и алексаморелин представляют собой гептапептидные соединения. В литературных источниках для них описана полная деградация 1п про и тигго ввиду наличия незащищенной ненатуральными и В-аминокислотами пептидной связи в первом положении.

Таким образом, ОНДЕР-1 очень быстро метаболизирует в человеческом организме, в результате чего выявление его приема возможно только по метаболитам. Стоит отметить, что при исследовании т ий"о мы идентифицировали следовые количества бар-1, что свидетельствует о высокой чувствительности нашего метода. Вопрос к.б.н. Якуниной НЛО.: 1) Во сколько раз сокращается время пробоподготовки и расход реагентов при замене ручного способа доведения рН разбавлением буферным раствором и использовании планшетов для микроэкстракции вместо картриджей'? Ответ: При расчете на 25 образцов мочи замена ручного способа доведения РН разбавлением буферным раствором позволяет сократить время пробоподготовки примерно на 30 мин.

При использовании планшетов для микроэкстракции расход реагентов сокращается в 3.5 — 4 раза. Вопрос Подольского И.И.: 1) Стандартные образцы какой фирмы Вы использовали в своей работе? Ответ: За исключением метаболитов ОНКР-6 и гексарелина стандартные образцы были синтезированы на заказ фирмой ТЬеппо Р1зЬег Яс1еп116с, Германия. Химическая чистота каждого стандартного образца подтверждалась сертификатом анализа. Стандартные образцы метаболитов ОНКР-6 и гексарелина предоставлены Катрин Гебель из австралийской антидопинговой лаборатории в Сиднее. Научные руководители соискателя к.б.н. Кротов Г.И. и к.х.н., доц. Ефимова 1О.А. в своем сообщении дали положительную характеристику Зверевой И.О.

4 При обсуждении с оценкой представленной работы выступили: к.х.н. Дикунец М.А., к,б,н. Никитина М.П., к.х.н. Бочкарева Н.Л. Все выступающие дали положительную оценку представленной диссертационной работы. По итогам обсуждения принято следующее заключение: Актуальность работы. Гормон роста (ГР) является одним из «скандально» известных допинговых препаратов. Увеличение концентрации ГР способствует росту мышечной и костной ткани, уменьшению жировой прослойки и ускорению восстановления работоспособности. Перспективы использования ГР в качестве допинга были описаны еше в 1982 году и после нескольких инцидентов приема препаратов ГР, он был включен в 1989 году в Запрещенных список, несмотря на отсутствие официально принятого метода определения.

Как и все лекарственные препараты пептидной природы, ГР характеризуется протеолитической нестабильностью и низкой биодоступностью, поэтому начиная с конца ХХ столетия активно ведутся поиски его аналогов с более простой химической структурой. Подобными аналогами являются соединения класса рилизинг-пептидов гормона роста, 1от англ. Сгорай Ьоппопе ге1еаз1п8 рер1Ыез, ОНКР), которые увеличивают концентрацию ГР путем стимуляции его выработки при связывании с рецептором грелина бНК-Ка1 в гипофизе, Данные соединения включены в Секцию Б2 «Пептидные гормоны, факторы роста, подобные субстанции и миметики» Запрещенного списка Всемирного антидопингового агентства (ВАДА).

Для идентификации ОНКР разработаны методики с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной массспектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) и конкурирующего связывания в присутствии изотопно меченого природного агониста грелина (' '1-грелин) с рецептором ОНЯКа1, экспрессированного на поверхности клеток НЕК293. В современном антидопинговом контроле применяется метод ВЭЖХ-МС/МС, позволяющий селективно идентифицировать большое количество соединений и их метаболитов в холе одного анализа.

Препараты пептидной природы в организме человека подвержены быстрой деградации, часто настолько стремительной, что исходное соединение не детектируется в биологических жидкостях уже через 24 часа после приема. Поэтому особый интерес представляет идентификация метаболитов ОНКР, что может увеличить временное окно детектирования после приема и достоверность идентификации данного вида допинга.