Автореферат (Биосенсоры на основе дрожжевой культуры и ассоциаций микроорганизмов для определения биохимического потребления кислород), страница 3

Для созданияискусственных ассоциаций, как наиболее перспективные, выбраны дрожжиродов O. аngusta, А.adeninivorans и D. hansenii.2. Составление искусственных ассоциаций микроорганизмовДля расширения спектра окисляемых субстратов и повышенияправильности определения биохимического потребления кислорода длясоздания БПК-биосенсоров используют ассоциации микроорганизмов, однакоони могут быть нестабильны во времени за счет изменения составаконсорциума. Изучив полученные данные по субстратной специфичностиисследуемых микроорганизмов (рисунок 2), а также проведя сравнительныйанализ продолжительности основных фаз роста культур (таблица 2), быливыбраны микроорганизмы для создания ассоциаций.Ассоциацию 1 составили микроорганизмы A.adeninivorans ВКМ Y-2677 иO.

angusta BKM Y-1397. Микроорганизмы A. adeninovorans обладают широкойсубстратной специфичностью (рисунок 2) и являются базовыми в ассоциации.Добавление к ним микроорганизмов O. angusta ВКМ Y-1397 позволяетрасширить спектр окисляемых субстратов за счет метанола и глицерина. Крометого, клетки A. adeninivorans ВКМ Y-2677 и O. angusta ВКМ Y-1397 имеютШтамм дрожжей11сходные фазы роста (таблица 2), и можно предположить, что доминированияклеток одного вида дрожжей над другим не произойдет.Таблица 2.

Продолжительность основных фаз роста дрожжейШтамм дрожжейЛаг Экспоне- ЛинейнаяФазаСтацио- Удельнаяфазазамедления нарная скоростьфаза, ч нциальнаяфаза, чроста, чроста,чфаза, ч роста, ч-1O. angusta ВКМ Y-1397А.adeninivorans ВКМ Y26770–1212–1616–3030–3838–500,1600–1010–1414–2828–3434–500,158А.adeninivorans ВГИ 78-60–1010–1818–2626–3838–500,144D. hansenii ВКМ Y-24820–88–1212–2020–4040–500,259D.

hansenii ВКМ Y-1110-1212-2020-3030-3838-500,324D. hansenii ВКМ Y-15850-1212-1818-2626-3636-500,324D. hansenii ВКМ Y-10500-1818-2828-3232-4040-500,252Ассоциацию 2 составили микроорганизмы A. аdeninivorans ВКМ Y-2677,O. angusta BKM Y-1397 и D. hansenii ВКМ Y-2482. Добавление дрожжей D.hansenii к ассоциации 1 позволяет еще расширить спектр окисляемыхсубстратов, включив в него некоторые нитрофенолы и пищевые добавки (4нитрофенол и бензоат калия).Нестабильность состава ассоциаций микроорганизмов во времениявляется главным препятствием к практическому внедрению БПК-биосенсоровна их основе, поэтому проведено исследование по выявлению количестважизнеспособных клеток в сформированных ассоциациях (рисунок 3).55A.adeninivorans ВКМ Y-2677O.angusta ВКМ Y-1397KOE*108KOE*10A.adeninivorans ВКМ Y-2677O.angusta ВКМ Y-1397D.

hansenii ВКМ Y-2482484321321000714212835420Время, дни71421283542Время, дниРисунок 3. Определение количества жизнеспособных клеток микроорганизмов вассоциациях в течение времени высевом на плотные питательные среды:А)ассоциациямикроорганизмов Б)ассоциациямикроорганизмовA.A.adeninivorans ВКМ Y-2677 и O.adeninivorans ВКМ Y-2677, O. angustaangusta BKM Y-1397BKM Y-1397 и D. hansenii ВКМ Y-2482.Результаты исследования (рисунок 3) показали, что соотношение клетокразных видов микроорганизмов в ассоциации A.adeninivorans BKM Y-2677 и O.angusta BKM Y-1397с течением времени не изменялось, поскольку данные12микроорганизмы имеют схожие удельные скорости роста.

Соотношениемикроорганизмов в ассоциации A. аdeninivorans ВКМ Y-2677, O. angusta BKMY-1397 и D. hansenii BKM Y-2482 изменилось только к концу периодаисследования и составило 1:1:4. По результатам анализа методом Коха,подтвержденных данными оптической микроскопии до 23 дня исследований,соотношение микроорганизмов в данной ассоциации практически не меняется.3.

Разработка матрицы на основе гидрогеля поливинилового спирта,модифицированногоN-винилпирролидоном,подходящейдляиммобилизации микроорганизмовКлючевым моментом в формированиистабильного рецепторногоэлементаБПК-биосенсора является иммобилизация микроорганизмов.Основными требованиями, предъявляемыми к матрицам для иммобилизациимикроорганизмов, являются: высокий уровень диффузии субстратов ипродуктов, нерастворимость в водных средах (наличие сетчатой структуры),высокая емкость, механическая прочность. Новым подходом прииммобилизации микроорганизмов, удовлетворяющим всем перечисленнымкритериям,является использование N-винилпирролидона (N-ВП) длямодификации поливинилового спирта (ПВС), с целью образования сетчатойструктуры геля и увеличения механической прочности.Для установления структуры получающегося сшитого полимера былопроведено изучение продуктов реакции методом ЯМР (рисунок 4).Рисунок 4.винилпирролидоном.1Н ЯМР-спектр поливинилового спирта модифицированного N-На протонном ЯМР-спектре раствора сополимера виден сигнал NH4+группы аммоний-церий нитрата (6.90-7.22 м.д.) и отсутствуют сигналы13протонов CH2=CH- группы N-винилпирролидона, что свидетельствует ополном протекании реакции.

В протоном спектре хорошо видны уширенныесигналы СН2(8) – 1.50-1.70 м.д. и СН(6,7) – 3.86-4.06 м.д. групп цепочкиполивинилового спирта. Сигнал СН2 (4)- группы обладает сильнопольнымхимическим сдвигом (1.27 м.д.) и однозначно относится к фрагменту сшивки.4. Иммобилизация дрожжей D. hansenii ВКМ Y-2482 и ассоциациймикроорганизмов в поливиниловый спирт, модифицированный NвинилпирролидономПолученный полимерный носитель (мольное соотношение компонентовПВС : инициатор : N-ВП = 160 : 7 : 1) на основе поливинилового спирта,модифицированного N-винилпирроидоном использован для иммобилизациидрожжевых клеток Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 и сформированныхассоциаций микроорганизмов.ВрезультатемодификацииполивиниловогоспиртаNвинилпирролидоном формируется гидрогель сетчатой структуры (рисунок 5Б) сразмерами пор от 1 до 5 мкм, что позволяет включать клетки дрожжей D.hansenii имеющие размер 3-4 мкм (рисунок 5В).А) Дрожжи DebaryomycesБ) Набухший гидрогельВ) Иммобилизованныеhansenii ВКМ Y-2482модифицированного ПВСдрожжи D.

hanseniiРисунок 5. Фотографии дрожжей и набухшего гидрогеля поливинилового спиртамодифицированногоN-винилпирролидоном,полученныеметодомсканирующейэлектронной микроскопииНаряду с применением искусственно составленных ассоциаций длясоздания рецепторных элементов БПК-биосенсоров использовали ассоциациюактивного ила с очистных сооружений, представленную в основномбактериальными микроорганизмами.Для сравнения основных характеристик разработанных БПК-биосенсоровиспользовали биочувствительные элементы с одинаковым содержаниеммикроорганизмов (20 мг клеток на 100 мкл гидрогеля поливинилового спиртамодифицированного N-винилпирролидоном).14Рисунок 6. Зависимости ответов биосенсоров от БПК5А) Полная зависимостьБ) Линейный участокДля каждой зависимости ответа биосенсора от БПК5 (рисунок 6 а)рассчитаны кажущиеся константы Михаэлиса (K’m) и максимальные скоростиферментативной реакции (Rmaх).

Аппроксимацию проводили по уравнениюМихаэлиса-Ментен:RRmax [ S ], где Rmax –  [S ]KMмаксимальная скоростьпотребления кислорода иммобилизованными микроорганизмами, достигаемаяпри [S]→∞, К’M – кажущаяся константа Михаэлиса, т.е. концентрациясубстрата, при которой R=Rmax/2.Для снижения ошибок анализа обычно ограничиваются использованиемлинейного участка градуировочной кривой (рисунок 6б).

Значение верхнейграницы определяемых концентраций выбирается равной константеМихаэлиса, К´м. Наибольшее значение этой характеристики получено дляассоциации дрожжей A. adeninivorans, O. angusta и D. hansenii и составило 80мг/дм3 (таблица 3).Таблица 3. Основные характеристики БПК-биосенсоров на основе ассоциациймикроорганизмов и дрожжей D. hanseniiБиочувствительныйэлемент/ Ассоциация АссоциацияАктивD.hanseniiхарактеристики21ный илПредел обнаружения, мг/дм3Нижняя граница определяемыхсодержаний БПК5, мг/дм3Верхняя граница определяемыхсодержаний БПК5, мг/дм3Максимальнаяскоростьферментативной реакции (Rmaх)Коэффициент чувствительности*10-5,с-1Долговременная стабильность,суткиОперационная стабильность, %Экспрессность, мин0,800,730,940,052,412,412,550,1680 ± 1042 ± 914 ± 330± 30,0190 ±0,00090,0090 ±0,00040,0020 ±0,00010,039±0,00410 ± 28±14±171± 27129428,938,547,632315Разработанные биосенсоры на основе ассоциаций микроорганизмовобладают близкими характеристиками (таблица 3).