Отзыв оппонента 3 (Структурные и каталитические свойства ферментов перекисного окисления липидов – 1215-липоксигеназ)

ОТЗЫВ официального оппонента на диссертационную работу Иванова Игоря Владимировича «Структурные и каталитические свойства ферментов перекисного окисления липидов - 12/15 липоксигеназ», представленную на соискание ученой степени доктора химических наук по специальности 02.00.10 — биоорганическая химия. Актуальность избранной темы Тема диссертационной работы Иванова Игоря Владимировича актуальна как для мировой, так и отечественной науки, так как является основой в области исследования липоксигеназ, ферментов, селективно окисляющих полиненасыщенные жирные кислоты с образованием уникальной группы биорегуляторов — оксилипинов.

Хотя липоксигеназы начали исследовать довольно давно и кристаллическая структура 12/15-липоксигеназы ретикулоцитов кролика была получена 20 лет назад, существует множество пробелов в области структурной биологии этого класса ферментов. Была недостаточно изучена роль малого 1ч-концевого домена в структуре фермента, процессы активации и инактивации 12/15-липоксигеназ, а также их аллостерические свойства. Многочисленные исследования последних лет указывают на ключевую роль этих ферментов процессах клеточной дифференцировки, в патофизиологическнх, в частности, воспалительных, процессах, в развитии атеросклероза, в нарушениях метаболизма костных и соединительных тканей, в возникновении резистентности к инсулину и ряде других патологий, однако исследования в области фармакологии по поиску и созданию препаратов на основе потенциальных ингибиторов 12/15-липоксигеназ не увенчались полноценным успехом. В связи с этим, данная научно-исследовательская работа, в которой предложена новая модель липоксигеназного катализа, учитывающая гибкость белковой структуры этого класса ферментов, приобретает особенную актуальность, так как она закладывает новую основу для формирования стратегии поиска потенциальных анти-атер осклеротическ их и противовоспалительных лекарственных препаратов.

Таким образом, актуальность темы диссертационной работы Иванова И.В. не вызывает сомнений. Оценка содержания диссертации, ее завершенности Диссертация Иванова И.В. состоит из семи глав, изложена на 235 страницах, включая список литературы, состоящий из 319 источников, 9 приложений, содержит 51 рисунок, 21 таблицу и 8 схем. Вводная часть диссертации состоит из оглавления, введения, актуальности проблемы, целей работы, практической значимости, апробации работы и описания личного вклада автора. Начальные главы диссертации построены не вполне традиционно. Отсутствует литературный обзор в виде отдельной главы.

Вместо этого, в первой, второй и третьей главах содержится обзор литературы, в котором приводятся также и некоторые экспериментальные данные автора. В обзоре рассмотрены последние достижения в области биохимии и биологии липоксигеназ и проведен их критический анализ. Далее следуют разделы обсуждение результатов (Главы 4-7), заключение и выводы. Выводы следуют из полученных результатов, четко их отражают. За выводами следует экспериментальная часть, в которой достаточно подробно описан арсенал использованных автором методов, разнообразие которых свидетельствуют о высокой экспериментальной квалификации автора, который сочетал в данной работе не только классические методы синтетической органической химии, биоорганической химии и биохимии, но и самые современные методами биофизики, молекулярной и структурной биологии, такие как моделирование молекулярной динамики, сайт-направленный мутагенез, динамическая флуоресценция, рентгеноструктурный анализ.

В приложении приведена дополнительная экспериментальная информация, за ним следует список сокращений, благодарности, список публикаций автора по теме диссертации и список цитируемой литературы. Диссертация представляет собой целостный и завершенный научный труд, содержание и структура которого соответствует всем существующим требованиям. Достоверность и новизна исследования, полученных результатов, выводов и рекомендаций, сформулированных в диссертации В диссертационной работе Иванова И.В. сформирован новый комплексный подход к изучению механизмов липоксигеназого катализа, сочетающий в себе разработку синтетических методов для получению фотоафинных зондов активного центра 12/15- липоксигеназ, аналогов природных лигандов этого класса ферментов, математическое и кинетическое моделирование, классических и новых методов биохимии и молекулярной биологии, а также структурные исследования макромолекул в растворе Экспериментальные данные с использование полученных зондов позволили впервые подтвердить данные существующих моделей субстрат-связывающей полости фермента 12/15 липоксигеназы.

Принципиальной научной новизной отличается раздел, посвященный изучению структуры фермента в растворе. Диссертант впервые показал, что в случае 12/15- липоксигеназы кролика этот фермент в водных растворах находится в обратимом равновесии мономер-димер, и что содержание димерной фракции сильно зависит от условий эксперимента, таких как концентрации белка, рН, а также присутствия лигандов активного центра размера.

Им были показаны ключевые аминокислоты, участвующие в димеризации белка, функциональность которых подтверждается данными направленного мутагенеза и рентгеноструктурного анализа. Впервые также получены данные о роли М- концевого домена, которая играет ключевую роль в стабилизации структуры достаточно гибкой молекулы 12/15-липоксигеназы Диссертантом впервые получены результаты принципиальной важности, касающиеся роли кислорода в ферментативной реакции с участием липоксигеназ.

Диссертанту с соавторами впервые удалось построить модель трехмерной карты распределения свободной энергии и экспериментально подтвердить, что кислород может проникать в активный центр на основе контролируемых механизмов. Степень обоснованности научных положений, выводов и рекомендаций, сформулированных в диссертации Принципиальные положения диссертации убедительно обоснованы и достоверны благодаря широкому арсеналу самых современных методов и подходов, примененных диссертантом. Достоверность данных не вызывает сомнений благодаря адекватности использованных методов поставленным задачам исследования, а также ввиду достаточного количества экспериментальных повторностей. Проведенный нами анализ позволяет заключить, что диссертационная работа Иванова И.В.

представляет собой комплексное научное исследование фундаментальных процессов, которое является заметным вкладом в энзимологию липоксигеназ, широко распространенного класса диоксигеназ, ответственных за окисление полиеновых жирных кислот и вовлеченных в регуляцию многих процессов, в том числе патофизиологических, на клеточном и организменном уровне у эукариот. Диссертационной работы Иванова И.В достаточно хорошо апробирована; ее содержание известно научной общественности благодаря опубликованным 22 экспериментальным статьям в ведущих международных и отечественных научных журналах и по 4 обзорам, получивших очень высокое цитирование, а также докладам на различных российских и международных конференциях. Диссертация логично построена и написана хорошим литературным языком.

Значимость дла науки и практики полученных автором результатов. Рекомендации по использованию результатов и выводов диссертации. Полученные Ивановым И.В. результаты имеют большую практическую значимость. По совокупности полученных результатов диссертантом предложена междисциплинарная платформа для изучения организации и функционирования биологических макромолекул в растворе. На основе результатов работы диссертанта могут быть разработаны новые подходы для разработки и создания высокоспецифичных потенциальных противовоспалительных и противоопухолевых препаратов. Кроме того, разработаны экспериментально подтвержденные теоретические подходы для оценки энергии распределения и динамики диффузии Оь которые могут быть использованы для изучения распределения других малых гидрофобных молекул, таких как ЯО, СО, СОь в структуре макромолекул.

Помимо потенциального применения в области молекулярной фармакологии, результаты работы могут быть использованы в курсах лекций по биохимии, биоорганической химии, медицинской химии для студентов ВУЗов. Качество опубликованных работ по теме диссертационного исследования, степень участия автора По теме диссертационного исследования автором было опубликовано 22 экспериментальные статьи, преимущественно — в международных журналах с высокими импакт-факторами, в частности, СЬет. Вю1., Вюогя. Мед. СЬет., Те1гаЬедгоп, СЬегп.

РЬуз. 1лр1дз., ВюсЬеппз1гу, РЕВЯ 3., ВюсЬеш1зпу, СЬешВюСЬеш, Ргос. Ь1а11. Асад. Бс1 1)ЯА, СЬеш1з1гу Епг. 3., ВюсЬ1т. ВюрЬуз. Ас1а, Огя. Вюшо1. СЬет., 3. Мо1. Вю1., Ргоге1па. Помимо экспериментальных работ, опубликовано 4 обзорных статьи в ВюсЬеш. ВюрЬуз. Вез. Сотпшп., АгсЬ. ВюсЬеш. ВюрЬуз., Оепе и Вестник МИТХТ. Кроме того, результаты работы опубликованы в 18 тезисах российских и международных научных конференций, и симпозиумов, что отражает высокую степень апробации работы.

Во многих статьях, в том числе — обзорных, диссертант является первым автором, что свидетельствует о его существенном личном вкладе в опубликованных работах. Замечания н вопросы к содержанию диссертационной работы Оппонент не имеет замечаний принципиального характера к рецензируемой работе. Работа имеет достаточно высокую степень новизны и выполнена на очень высоком методическом уровне.