Отзыв на автореферат 3 (Структурные и каталитические свойства ферментов перекисного окисления липидов – 1215-липоксигеназ)

ПереводОтзыв и оценка автореферата докторской диссертации Иванова И.1. Тема диссертацииЛипоксигеназы (LOX) - ферменты каскада перекисного окисления липидов - участвуютне только в процессах клеточного созревания клеток и их дифференцировки, но и впатогенезе ряда заболеваний, таких как атеросклероз, опухолевые заболевания инейродегенеративные расстройства. У млекопитающих они были обнаружены всередине 1970 года, и с тех пор исследование LOX является одним из основныхнаправлений биохимии и фармакологии. Хотя кристаллические структуры несколькихизоформ LOX млекопитающих были получены относительно недавно, многие аспектымеханизма катализа реакции LOX, включая молекулярные основы их активности,ингибирования, не были детально изучены.Докторская диссертация Иванова И.

посвящена трем основным аспектам в областисовременных исследований LOX:1. Механизмы взаимодействия фермента с лигандом. Разработка новых подходов истратегий для полного синтеза зондов активного сайта LOX.2. Двойная роль кислорода в реакции LOX. Транспорт кислорода в молекуле белка, иего роль в реакции LOX.3. Изучение структуры LOX, включая образование нековалентных димеров фермента.Для реализации первой темы исследований заявителем синтезирован ряд зондовактивного центра фермента, и разработана стратегия синтеза ингибиторов LOX. Этизонды были использованы для изучения взаимодействия фермент-лиганд.Полученные данные предоставляют ценную информацию о механизмах связыванияLOX и их субстратов и способствуют пониманию процессов в ряду взаимодействийфермент-субстрат.Липоксигеназы (LOX) как ферменты каскада перекисного окисления липидов требуютприсутствия молекулярного кислорода в качестве субстрата.

Долгое время оставалосьнеизвестным, каким образом атмосферный кислород проникает в находящийся вглубине белковой молекулы каталитический центр фермента. Было предположено, чтосуществуют специальные диффузионные каналы доступа кислорода из растворителя вкаталитический центр фермента. Тем не менее, экспериментального подтверждениясуществования таких каналов не было получено в течение многих лет. Применениекомбинированной стратегии исследований с участием компьютерного моделированияи сайт-специфического мутагенеза позволила идентифицировать различные каналыдоступа кислорода к жирнокислотному субстрату, связанному в активном центре.Заявителем было показано, что молекулярный молекулярный кислород служит нетолько в качестве второго субстрата в реакции LOX, но что он также являетсяактиватором фермента.

Несмотря на то что подробные механизмы подобнойкислород-зависимой активации LOX не выяснены, эти данные объясняют многиекинетические свойства этих ферментов, которые не могли быть объяснены ранее.Кристаллические структуры различных изоформ LOX млекопитающих были полученыотносительно недавно, однако в водных растворах структура этих ферментов можетизменяться. При исследовании структуы ALOX15 кролика наблюдалась высокаястепень пространственной подвижности между двумя основными LOX доменами.Такая подвижность была ограниченаа путем мутации аминокислотных остатков,расположенных в плоскости контакта между N-концевой и каталитическойсубъединицей. Кроме того, заявитель обнаружил возможность обратимойдимеризации фермента, процесса, который зависит от ионной силы раствора, от рН иконцентрации фермента.

Модификация равновесия мономер-димер не только влияетна структурные, но и на функциональные свойства LOX. Кроме того, в работеохарактеризовны каталитические свойства и термостабильность различных мутантовALOX15.2. Методический профильВ докторскаой диссертации используется методологичесая база, которая включает всебя широкий спектр различных аналитических и препаративных процедур,направленных на решение двух разных проблем:а) Химический синтез и структурные исследования лигандов активного сайта LOX,которые включают в себя характеристику биологических эффектов вновьсинтезированных соединений.

Эти методы включают в себя стандартные и новыеметодики химического синтеза, а также методы физико-химического анализа, таких какэлементный анализ, различные методы хроматографии, УФ- и ИК-спектроскопия, MSвысокого разрешения, а также 1Н- и 13С-ЯМР.б) Получение нативных и рекомбинантных препаратов изоформ ALOX. Диссертантомвыделены различные изоформы ALOX15 как в виде нативного фермента(ретикулоциты кролика), так и в виде рекомбинантного препарата (E.coli).

Ферментныепрепараты были очищены с использованием различных методов очистки белков(осаждение сульфатом аммония, ионообменная хроматография, гель-фильтрация,аффинная хроматография, изоэлектрическое фокусирование) и охарактеризованы сприменением прикладных аналитических методов: ряд методов ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ, НФВЭЖХ, хиральная фаза), методов ГХ/МС для установления структуры окисленныхлипидов, образующихся при взаимодействии LOX с различными субстратами –ненасыщенными жирными кислотами.

В дополнение к этим стандартным методам ониспользовал более сложные аналитические процедуры, такие как малоугловоерентгеновское рассеяние (МРР), которые требуют сложной процедуры обработкипервичных экспериментальных данных.3. Основные научные результатыВажнейшие результаты, полученные в данной работе, можно выделить в триразличные группы:Темы 1: Механизм взаимодействия липоксигеназ с лигандом.

Разработка новыхподходов и стратегий для полного синтеза зондов активного центра LOX.A) Диссертантом синтезирован ряд новых терминальных (омега-модифицированных) исубтерминальных (омега-3 и омега-4 модифицированных) производных арахидоновойкислоты, которые впоследствии были использованы в качестве зондов для изученияреакции ALOX15. Для этой цели была разработана синтетическая стратегия,основаная на синтезе ацетиленовых предшественников. Конечные продукты синтезабыли охарактеризованы в соответствии со стандартами физико-химического анализа.При использовании модифицированных жирных кислот в качестве субстратанаблюдались изменения в реакционной специфичности и кинетических свойствахреакции LOX.

Эти данные свидетельствовали о том, что терминальная часть субстратавступает в контакт с ферментом в активном центре.Б) Диссертантом синтезировано несколько зондов активного центра, которыеиспользовались для экспериментов по исследованию механизмов действия LOX.

Спомощью этих соединений было обнаружено, что некоторые из них приводят кковалентной модификации фермента.С) Структурное сравнение (2Z)-2-(3-бензилиден)-3-оксо-2,3-дигидробензо[бета]тиофен7-карбоновой кислоты с другими ингибиторами LOX показало способность этогосоединения ингибировать ALOX15 кролика, однако его ингибирующая активность поотношению к препаратам 12/15-липоксигеназы довольно низка.

Тем не менее,фотоактивация, которая индуцирует изомеризацию Z-Е двойной связи, значительноувеличивала активность ингибитора до IC50 0,021 мМ. Структурное моделированиекомплекса фермент/ингибитор раскрыло молекулярные причины специфичности.этогоизомера.Тема 2: Двойная роль кислорода в реакции LOX. Его внутрибелковый транспорт и егороль в реакции LOX.А) В дополнение к полиеновым жирнм кислотам молекулярный кислородпредставляет второй субстрат LOX. Диссертант убедительно показал, чтоатмосферный молекулярный кислород не только используется в качестве субстратадля окисления жирных кислот, но и является одним из важных активаторов фермента.Диссертантом впервые показано, что в случае, когда кислород становитсялимитирующей функцией, каталитическая лаг-фаза удлиняется и скорость реакциипонижается.

Этот эффект впоследствии был подтвержден для других LOX-изоформ вразличных экспериментальных условиях.Б) Диссертант и его коллеги применили комплексную стратегию, включающуюструктурное моделирование и молекулярную динамику, сайт-специфический мутагенези кинетические исследования с целью изучения распределения молекулярногодикислорода внутри фермента ALOX15 кролика. Были проведены расчетыраспределения свободной энергии для кислорода, что позволило обнаружить четырепотенциальных канала в молекуле белка. Все каналы соединяют поверхностиь белка собластью высокого сродства к кислороду в активном центре. Эта областьлокализована в области негемового железа, что позволяет объяснить специфичностьреакции этой изоформы липоксигеназы.

Каталитически наиболее релевантный путьбыл затруднен при проведении мутации L367F и сопровождался сильным повышениемконстанты Михаэлиса для кислорода. Эти результаты убедительно доказывают, чтоосновной путь доступа кислорода к активному центру фермента проходит через канал,образованный из непостоянно соединенных между собой полостей.Тема 3: Изучение структуры LOX, включая образование нековалентных димеровфермента.А) Молекулы LOX состоят из двух доменов (N-концевогно домена примерно в 150аминокислот и каталитического домена размером в 500 аминокислот), которыесоединены между собой с помощью гибкой петли. Предыдущие исследования сприменением малоуглового рентгеновского рассеяния показали, что эти структурныесубъединицы могут перемещаться относительно друг друга в водных растворах, и чтоэта структурная подвижность может оказать непосредственное влияние накаталитическую активность фермента.

Диссертант подтвердил эти выводы иобнаружил аминокислотные остатки в плоскости междоменного контакта (Tyr98,Tyr614), которые участвуют в междоменным движении. С помощю сайтспецифического мутагенеза этих остатков он получил и охарактеризовал ферментныепрепараты, как с повышенной степенью, так и ограничением междоменовойподвижности.Б) Липоксигеназы являются цитозольнми ферментами, которые, как предполагают,функционируют в виде мономеров. Для ALOX15 кролика диссертантом показноналичие обратимого мономер-димерного равновесия в водных растворах,относительная доля димеров в котором сильно зависит от условий эксперимента,таких как концентрации белка, рН и наличие лигандов активного центра. Он такжеопределил ключевые аминокислоты, участвующие в димеризации белка, и подтвердилих функциональность с использованием сайт-направленного мутагенеза.

Аналогичнаядимеризация белка также известна для ALOX5 человекаС) Arg403 ALOX15 кролика участвует в процессах связывания субстрата.Предполагается, что его положительно заряженный остаток взаимодействует сотрицательно заряженной карбоксильной группы жирной кислоты. С другой стороны,боковая цепь Arg403 является частью ионной сети с остатками спирали альфа 2,которая подвергается конформационным изменениям при связываниеи фермента сингибитором. При изучении роли Arg403 в процессах катализа с помощю сайтнаправленного мутагенеза и динамической флюоресценции диссертантом былипоказаны структурные и функциональные изменения фермента, связанные с мутацией.Диссертант обнаружил, что потеря электростатического взаимодействия между Arg403и отрицательно заряженными аминокислотными остатками спирали альфа 2 имеетнезначительное влияние на фолдинг белка, но частично дестабилизирует еготретичную структуру.D) Ортологи ALOX15 способны окислять фосфолипиды в составе биомембран, однакомолекулярные механизмы процессов мембранного связывания недостаточно изучены.Диссертантом были изучены процессы мембранного связывания LOX растений имлекопитающих с использованием измерений флуоресценции при высоком давлении ипри различных температурах.