Отзыв ведущей организации (Структурные и каталитические свойства ферментов перекисного окисления липидов – 1215-липоксигеназ)

«УТВЕРЖДАЮ» ФАНО РОССИИ Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэлн Российской академии наук 1ИБХ117 1'АН) Косыгина ул., д. 4, Москва, 119334, Тела (4991 137-84-20, факс: (499] 137-41-01 Е-гва((яосрг0вКу.слрл.ганги директор Федерального государствев(- ного бюджетного учреждения науки Институт биохимической физики им.

Н.М. Эмануэля Российской академии наук, проф. Курочкин И.Н. ОКПО 40241274, ОГРН 1037739?74308 ИНН/КПП 773Б043893/773801001 ~~„у~ ~~~7-~.З х от на Не ОТЗЫВ ведущей организации — Федерального государственного бюджетного науки «Институт биохимической физики им. Н. М. Эмануэля» РАН о диссертационной работе ИВАНОВА ИГОРЯ ВЛАДИМИРОВИЧА «Структурные и каталитические свойства ферментов перекисного окисления липидов — 12/15-липокснгеназ», представленной на соискание ученой степени доктора химических наук по специальности 02.00.10 - биоорганическая химия Диссертационная работа Иванова Игоря Владимировича посвящена актуальному направлению биоорганической химии - изучению структурных и каталитических свойств ферментов каскада окисления арахидоновой кислоты — 12/15-липоксигеназ с целью формирования основ для рационального дизайна и последующего создания новых высокоэффективных лекарственных средств для применения в медицине в качестве противовоспалительных и противоопухолевых агентов.

Актуальносгпь обусловлена тем фактом, что 12/15-липоксигеназы млекопитающих непосредственно связаны с регуляцией физиологических процессов н липидного гомеостаза живой клетки. Ключевая роль липоксигеназ в патогенезе воспалительных и гиперпролиферативных заболеваний (возникновения и развития атеросклероза, дифференциации клеток и их метастазирования, воспаления жировой ткани и возникновения резистентности к инсулину) сделала их потенциальной мишенью при разработке препаратов для лечения многих заболеваний. На протяжении последних 20 лет были предприняты многочисленные попытки создания препаратов на основе ингибиторов 12/15-липоксигеназ, однако ни один из них не прошел клинических испытаний вследствие их низкой специфичности и наличия ряда побочных эффектов.

Главная причина подобных неудач заключается в том, что в основу стратегии поиска лекарственных препаратов положены данные статической кристаллической структуры 12/15-ЬОХ кролика, которые не учитывают динамику внутри- и межмолекулярной организации молекул этой группы ферментов в физиологической среде.

По результатам данной работы создана концептуально новая структурно-кинетическая модель, в основу которой положен динамический характер взаимодействия этого фермента, как с субстратом (полиненасыщенной жирной кислотой), так и со вторым лигандом - кислородом - в условиях конформационной подвижности белковой матрицы. В связи с этим, данная научно-исследовательская работа приобретает особенную актуальность, так как она закладывает новую основу для формирования стратегии поиска потенциальных анти-атеросклеротических и противовоспалительных лекарственных препаратов.

Работа Иванова И.В. построена по традиционному плану и состоит из семи глав, изложена на 235 страницах, включая список литературы, состоящий из 319 источников, и 9 приложений, содержит 51 рисунок, 21 таблицу и 8 схем, Формулировка проблемы исследования, цель и задачи работы приведены во введении. В первой и второй главах содержится обзор литературы, в котором рассмотрены последние достижения в области структурной биологии и эволюции липоксигеназ.

Обсуждается использование существующих в настоящее время экспериментальных и теоретическх подходов, применяемых при исследовании липоксигеназ. Приведены известные сведения о кристаллической структуре фермента и данные о механизме ферментативного катализа. Проведен критический анализ роли различных структурных элементов белка в процессе ферментативного катализа с участием липоксигеназ. Обсуждены также эволюционные аспекты этой группы ферментов. В третьей главе автор сделал критический вывод о существующих пробелах и недостатках в области исследования ферментов семейства липоксигеназ и предложил перечень задач, которые необходимо решить для достижения поставленной цели.

Основные результаты диссертационной работы и нх обсуждение содержатся в последующих главах, посвягценных разработке методов химического синтеза зондов активного центра липоксигеназ как на основе субстратов„производных арахидоновой кислоты, так и ингнбиторов фермента, изучению взаимодействия 12/15-1.0Х с лигандом и исследованиям структуры фермента в растворе. В конце каждой главе приведен анализ полученных результатов. К несомненной заслуге автора необходимо отнести разработку стратегии полного химического синтеза зондов активного центра ЬОХ на основе набора новых региоизомерных аналогов арахидоновой кислоты, содержащих азидогруппу в качестве фотоаффинной метки в различных положениях молекулы и изучение их особенностей и механизмов взаимодействия в ряду фермент — субстрат.

Особый интерес представляет та часть работы„в которой предложена и использована междисциплинарная платформа для изучения организации и функционирования биологических макромолекул в растворе, сочетающая в себе комбинацию методов направленного мутагенеза, малоуглового рентгеновского рассеяния (МРР), кругового дихроизма и динамической флуоресценции.

С использованием предложенной стратегии детально изучена динамика структуры 12/15-липоксигеназ в растворе и впервые показана возможность образования переходного димерного комплекса этого фермента в присутствии лиганда. Полученные данные позволяют предположить, что в переходном димере 12/15- липоксигеназ обе молекулы фермента могут работать совместно, контролируя и координируя процессы связывания с субстратом и диссоциации продукта. Этот материал подтвержден кинетическими исследованиями для нескольких типов субстратов и наглядно иллюстрируется таблицами, также обсуждаются молекулярные аспекты влияния тех или иных изменений в структуре молекулы фермента на его каталитическую активность. Данный материал в диссертационной работе представляется наиболее значимым, так как он закладывает теоретические основы для рационального дизайна новых лекарственных средств. Следует также отметить раздел, в котором обсуждается роль кислорода в реакциях с участием липоксигеназ и механизмы его транспорта в активный центр фермента.

Предложенна экспериментально подтвержденная и расширенная кинетическая модель липоксигеназной реакции, которая впервые учитывает двойственную роль кислорода в реакции липоксигеназного окисления: он служит не только субстратом, но и может быть активатором фермента, что является его новой ранее не описанной функцией в случае липоксигеназ.

Более того, результаты экспериментальных и теоретических исследований, проведенных в данной работе, дают возможность предположить наличие механизмов строго контролируемого транспорта кислорода в молекуле г12/15-ЬОХ через динамические полости, соединяющие участки поверхности белка с областью каталитического центра. Экспериментальная часть содержит подробное описание синтеза всех полученных соединений.

Чистота синтезированных производных подтверждена методом ВЭЖХ, а структуры подтверждены набором современных методов физико-химического анализа — УФ, ИК- и ЯМР-спектроскопией, а также методами масс-спектрометрии, в том числе массспектрометрией высокого разрешения. Заслуживает внимания часть «Приложениягч в которой приведены аналитические данные по получению и выделению как природного (рекомбинантного), так и мутантных препаратов 12/15-липоксигеназ, приводятся сведения о чистоте их препаратов. Диссертационная работа Иванова И.В.

отличается существенной научной ноаизной. В ходе выполнения работы сформировано новое направление по изучению динамического липоксигеназого катализа, сочетающее в себе разработку синтетических подходов к получению аналогов природных лигандов 12/15-липоксигеназ, математическое и кинетическое моделирование, методы биохимии и молекулярной биологии, а также структурные исследования макромолекул в растворе: - предложен дизайн и разработана стратегия полного химического синтеза зондов активного центра 12/15-липоксигеназ на основе новых региоизомерных аналогов арахидоновой кислоты, содержащих азидогруппу в качестве фотоаффинной метки; - с использованием полученных соединений изучены механизмы взаимодействия в ряду фермент — субстрат и впервые в условиях образования неустойчивых ферментсубстратных комплексов 12/15-липоксигеназ показана возможность непосредственного участия кислорода, второго липоксигеназного субстрата, в процессах активации фермента; - на основе компьютерного моделирования молекулярной динамики с участием кислорода создана экспериментально подтвержденная модель, описывающая механизмы транспорта кислорода в белковой матрице 12/15-липоксигеназ; - впервые с применением комбинированной стратегии направленного мутагенеза, малоуглового рентгеновского рассеяния (МРР), кругового дихроизма и динамической флуоресценции проведено детальное изучение внутри- и межмолекулярной организации 12/15-липоксигеназ в динамическом окружении раствора; - впервые показана возможность динамического равновесия мономер-димер между молекулами 12/15-липоксигеназ, и образования переходного димерного комплекса этого фермента в присутствии лиганда в растворе.

Полученные Ивановым И.В. результаты имеют не только фундаментальную научную ценность, но и большую практическую значимость. По совокупности полученных результатов предложена междисциплинарная платформа для изучения организации и функционирования биологических макромолекул в растворе. Разработаны экспериментально подтвержденные теоретические подходы для оценки энергии распределения и динамики диффузии Оз, которые могут быть использованы для изучения распределения других малых гидрофобных молекул, таких как ХО, СО, СОь в структуре макромолекул. Разработанная стратегия синтеза фотоафинных зондов основана на использовании впервые полученных ацетиленовых предшественников природных (в/о-4)-гидроксилированных производных арахидоновой кислоты„ что обеспечивает возможность выхода к целому ряду новых перспективных, в том числе меченных тритием соединений, и возможности реализации комбинаторного подхода при их синтезе.

Основные научные результаты по теме диссертации изложены в 44 печатных работах, из них 26 опубликованы в ведущих рецензируемых научных изданиях, внесенных в Перечень журналов и изданий, утвержденных Высшей аттестационной комиссией, 24 из них цитируются ресурсом Ясорпз (и-индекс Иванова И.В 12), и 18-тезисами докладов на международных и российских научных конференциях и симпозиумах. Материал, изложенный в диссертации Иванова И.В., полностью соответствует содержанию опубликованных работ.

Замечаиия. Несмотря на высокий научный уровень работы в целом, в ней встречаются опечатки и некоторые неудачные выражения. Хотелось бы также более подробное, детальное формулирование стратегии выбора типа фотоафинной метки газидогруппы) и привести примеры и механизм ее использования на других объектах в молекулярной биологии. Отмеченные недостатки не затрагивают, безусловно, существа основных выводов диссертации и носят частный характер.