Аллельные варианты генов-кандидатов подверженности туберкулезу у русского населения Западной Сибири

Оглавление

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Роль наследственных факторов в возникновении и развитии туберкулеза

1.2 Молекулярные механизмы патогенеза туберкулеза у человека

1.3 Физиологические функции белковых продуктов генов-кандидатов подверженности туберкулезу, их роль в патогенезе заболевания

2. Материал и методы исследования

2.1 Обследованные группы населения

2.1.1 Характеристика контрольной выборки

2.1.2 Характеристика выборки больных туберкулезом

2.1.3 Характеристика семейной выборки пробандов, больных туберкулезом

2.2 Методы исследования

2.2.1 Клинико – лабораторные методы исследования

2.2.2 Молекулярно – генетические методы анализа полиморфизма генов

2.2.3 Генетико – статистические методы анализа

3. Результаты и обсуждение

3.1 Распространенность полиморфизма генов NRAMP1, VDR, IL12B, IL1B, IL1RN среди здоровых лиц (контрольная группа)

3.2 Анализ связи полиморфизма генов NRAMP1, VDR, IL12B, IL1B, IL1RN с туберкулезом

3.3 Анализ накопления случаев туберкулеза в семьях больных

3.4 Анализ связи полиморфизма генов NRAMP1, VDR, IL12B, IL1B, IL1RN с патогенетически важными параметрами болезни

3.4.1 Анализ ассоциаций исследованных генов с качественными признаками туберкулеза

3.4.2 Анализ ассоциаций исследованных генов с количественными признаками туберкулеза

Заключение

Выводы

Список литературы

Список сокращений

ТБ – туберкулез

ВОЗ – всемирная организация здравоохранения

МБТ – микобактерии туберкулеза

ГЗТ – гиперчувствительность замедленного типа

СОЭ – скорость оседания эритроцитов

РХФ – равновесие Харди-Вайнберга

NRAMP1 – макрофагальный белок, ассоциированный с естественной ресистентностью

NRAMP1 – ген макрофагального белка, ассоциированного с естественной резистентностью

MBP – маннозо - связывающий белок

TNFα – фактор некроза опухолей α

TNFА – ген фактора некроза опухолей α

VDR – ген рецептора к витамину D

HLA – главный комплекс гистосовместимости человека

INF-γ – гамма интерферрон

IL-1β – интерлейкин-1β

IL-12β – интерлейкин-12β

IL1B – ген интерлейкина-1β

IL12B – ген интерлейкина-12β

IL1RN – ген антагониста рецептора к интерлейкину-1β

Введение

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) от туберкулеза (ТБ) ежегодно умирают более двух миллионов человек во всем мире. В связи с этим в 1993 г. ТБ объявлен всемирной опасностью. Несмотря на наметившиеся тенденции к стабилизации и позитивную динамику отдельных показателей, эпидемиологическая ситуация по туберкулезу в Российской Федерации остается сложной [Перельман М.И., 2001; Онищенко Г.Г., 2003; Ерохин В.В., 2003; Белиловский и др., 2003]. В 27 субъектах РФ уровень заболеваемости значительно выше, чем по стране, причем наибольшие показатели отмечены в Сибирском федеральном округе [Мурашкина Г.С. и др., 1999; Краснов В.А., 2004]. Таким образом, ТБ является одной из самых серьезных медико-социальных проблем здравоохранения, как Томской области, так и в целом России [Перельман М.И., 2003; Стрелис А.К., 2004].

Несомненно, ключевым звеном патогенеза заболевания является проникновение микобактерий туберкулеза (МБТ) в организм человека. Однако нельзя недооценивать роль предрасполагающих факторов, к которым относят возраст больного, сопутствующие заболевания, неблагоприятное влияние факторов внешней среды, различные патологические состояния специфического и неспецифического иммунитета [Давыдовский И.В., 1962].

Известно, что туберкулезной инфекции свойственен выраженный клинический полиморфизм [Пузик В.И. и др., 1973]. Основой для такой вариабельности клинического течения болезни является не только внешние средовые причины, но и генетически детерминированные [Апт А.С и др., 1982; Хоменко А.Г., 1990]. Благодаря врожденной относительной резистентности человека к туберкулезу заболевает лишь малая часть инфицированных МБТ, в то время как, по данным ВОЗ, инфицируется практически каждый третий житель планеты.

Близнецовые и генетико-эпидемиологические исследования установили важную роль наследственности в развитии туберкулеза [Чуканова В.П. и др., 2001; Kallman F., Reisner D., 1943; Comstock G.W., 1978; Fine P.E.M., 1981].

С генетической точки зрения ТБ, как и большинство инфекционных заболеваний, относят к мультифакториальной патологии, которая представляет собой результат сложного взаимодействия большого числа генов с разнообразными факторами окружающей среды [Мороз А.М., Торонджадзе В. Г., 1977; Березовский Б.А. и др., 1986]. Современные достижения в области молекулярной генетики открыли новые перспективы в изучении патогенеза болезней: появилась возможность идентифицировать гены, продукты экспрессии которых принимают участие в развитии патологических состояний [Hill A. V. S., 1999].

Важнейший этап патогенеза туберкулеза - персистенция возбудителя в фагосомах макрофагов [Авербах М.М. и др., 1982; Литвинов В.И. и др., 1983]. Макрофаги поглощают патоген в очагах воспаления, но часто теряют способность элиминировать его в лизосомах, что в итоге приводит к их массированному размножению и последующему выходу из погибших клеток [Myrvik Q. et al., 1984]. В связи с этим в число генов-кандидатов туберкулеза входят гены, продукты которых участвуют в процессе фагоцитоза микобактерий. Современные характеристики туберкулезной инфекции диктуют необходимость контроля прохождения микобактерии по эндосомально – лизосомальному пути.

Одним из методов анализа роли генетических факторов в возникновении и развитии распространенных заболеваний является исследование ассоциаций генетических маркеров с заболеваниями [Пузырев В.П., 2000; Collins F.S., 1999; McKusick V., 2000]. В основе такой ассоциации маркера с болезнью могут лежать три причины. Во-первых, наличие ассоциации может свидетельствовать о том, что ассоциированный локус и есть ген или один из генов болезни. Во-вторых, причиной ассоциации может быть неравновесие по сцеплению между маркерным локусом и локусом болезни. И, наконец, ассоциация может быть артефактом, возникшим вследствие подразделенности популяции [Пузырев В.П., Степанов В.А., 1997]. Феномен ассоциации генетического маркера с заболеванием или каким-либо признаком болезни определяется дифференциальной приспособленностью носителей разных генотипов [Алтухов Ю.П., 2003].

Одним из приоритетных направлений в активном выявлении туберкулеза является определение групп риска. Формирование этих групп требует методологически правильного подхода, основанного на четком знании факторов, определяющих повышенный риск заболевания [Горбач Н.А. и др., 2004]. Методами молекулярной медицины было установлено, что у человека гены многих ферментов, рецепторов и других белков характеризуются наличием одного или нескольких структурных полиморфизмов, которые не приводят к значимым изменениям первичной структуры белка, и соответственно, очевидным патологическим последствиям, но оказывают влияние на функциональную активность кодируемых белков. Эти специфические для конкретной патологии маркеры могут быть выявлены задолго до ее клинической манифестации, что позволит определить группы риска, организовать их мониторинг, а в случае необходимости, предложить индивидуально обоснованную профилактику и превентивную терапию. Таким образом, идентификация генов и их аллелей, участвующих в определении чувствительности или резистентности к туберкулезу, позволит не только глубже проникнуть в фундаментальные механизмы иммунитета и патологии этой инфекции, но и будет способствовать усовершенствованию лечебно-профилактических мероприятий.

Настоящее исследование является фрагментом изучения подверженности к туберкулезу в различных этнических группах, которое проводится в ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН под руководством академика РАМН В.П. Пузырева. Получены результаты исследования роли генов-кандидатов в возникновении и развитии туберкулеза у тувинцев [Рудко А.А., 2004]. Нами изучено влияние генов NRAMP1 (ген макрофагального белка, ассоциированного с естественной резистентностью), VDR (ген рецептора к витамину D), IL12B (ген интерлейкина 12В), IL1B (ген интерлейкина 1В), IL1RN (ген антагониста рецептора к интерлейкину 1В) на предрасположенность к туберкулезу у русских г. Томска. Выбор сходных полиморфизмов генов для оценки резистентности к ТБ у тувинцев и русских позволил провести сравнительный анализ распространенности исследованных маркеров у больных и здоровых представителей данных этнических групп населения.

Цель исследования: изучить роль полиморфных вариантов генов NRAMP1, VDR, IL12B, IL1B и IL1RN в возникновении и развитии туберкулеза у русских жителей г. Томска.

Задачи исследования:

1. Изучить распространенность и межлокусное взаимодействие полиморфных вариантов гена NRAMP1 (469+14G/C, D543N, C274T, 1465-85G/A), аллельных вариантов генов VDR (B/b, F/f), IL12В (A1188C), IL1B (+3953A1/A2), IL1RN (VNTR) у русских г. Томска.

2. Оценить частоту встречаемости больных туберкулезом среди родственников больных и здоровых лиц.

3. Провести анализ ассоциаций полиморфизма исследуемых генов с туберкулезом.

4. Исследовать влияние изучаемых аллельных вариантов на варьирование патогенетически значимых признаков болезни.

5. Провести сравнительный анализ русских г. Томска и жителей Тувы по распространенности исследованных генов, гаметическому неравновесию между парами полиморфизмов генов и выявленным ассоциациям.

Научная новизна:

Впервые получены сведения о распространенности аллельных вариантов генов NRAMP1, VDR, IL12B, IL1B, IL1RN у русских жителей г. Томска. Проведен межпопуляционный сравнительный анализ генов-кандидатов туберкулеза у русских и тувинцев, установивший отличия в распределении генотипов и частот аллелей по всем исследованным генетическим маркерам. Показано, что структура неравновесия по сцеплению между полиморфизмами гена NRAMP1 идентична у русских и тувинцев. Изучено влияние полиморфизма генов-кандидатов туберкулеза на возникновение и развитие различных клинических вариантов заболевания. Впервые выявлены ассоциации полиморфизма +3953А1/А2 гена IL1B c ограниченным деструктивным ТБ легких, VNTR полиморфизма гена IL1RN и полиморфизма 274С/Т гена NRAMP1 с распространенной деструктивной формой заболевания, полиморфизма 1465-85G/A гена NRAMP1 с первичным туберкулезом и полиморфизма 1188А/С гена IL12B как с распространенным деструктивным туберкулезом легких, так и с первичной по генезу формой патологии. Показана связь полиморфизма генов IL12B, NRAMP1 и VDR с патогенетически важными для ТБ качественными и количественными характеристиками патологического процесса: объемом поражения ткани легкого, деструктивными изменениями, уровнем палочкоядерных нейтрофилов, а также СОЭ у женщин.

Практическая значимость:

Полученные результаты исследования полиморфизма генов-кандидатов туберкулеза представляются важными для формирования представлений о взаимосвязи особенностей генофондных параметров популяции с закономерностями распространения этого инфекционного заболевания, позволяют глубже проникнуть в фундаментальные механизмы иммунитета и патологии ТБ. Сведения о вкладе полиморфизма исследованных генетических маркеров в формирование вариабельности подверженности к этому заболеванию, а также в определение различий клинических проявлений болезни, могут быть использованы при организации профилактических и лечебных мероприятий. Полученные данные могут быть полезны в уточнении стратегии формирования групп риска по заболеванию туберкулезом.

1. Обзор литературы

1.1 Роль наследственных факторов в возникновении и развитии туберкулеза

Туберкулез известен с глубокой древности. Об этом свидетельствуют многочисленные литературные данные и исторические факты. Научные материалы палеонтологов указывают на древний возраст микобактериальной инфекции. На костях древнеегипетских мумий эпохи бронзы удалось обнаружить несколько бесспорных туберкулезных поражений. Большая заслуга в этом принадлежит английскому исследователю Арманду Рафферу (1921) [Холмовская М.Б., 1997].

Некоторые признаки легочной чахотки описаны в египетских папирусах, а так же в произведениях древнейших китайских ученых и в священных книгах индусов [Хоменко А.Г., 1990]. Уже в те времена исследователи пытались объяснить вопрос, который интересовал многих. Почему некоторые люди более подвержены туберкулезу, чем другие?

Решалась эта проблема различными учеными по-разному, в зависимости от уровня знаний в тот или иной период человеческой истории. Гиппократ, а так же его современники считали туберкулез наследственной болезнью: "Некоторые – более устойчивы в болезнях, другие совершенно не способны им противостоять. Как от родителей эпилептиков рождаются дети-эпилептики, так от чахоточных рождаются дети предрасположенные к чахотке" [Цит. по Рабухин А.Е., 1959].

Однако уже в те времена высказывалась мысль о заразности легочной чахотки. Так в Персии, по свидетельству Геродонта, обычно изолировали не только "прокаженных, но и чахоточных и золотушных" больных, запрещали им оставаться в городах и поддерживать какую-либо связь с окружающим населением [Рабухин А.Е., 1948].

С открытием возбудителя туберкулеза роль наследственности при этом заболевании фактически перестала признаваться. В течение длительного времени во фтизиатрии основное внимание уделялось изучению возбудителя болезни, патологических изменений и их клинических проявлений.

В настоящее время общепризнанно, что этиологическим фактором туберкулеза являются микобактерии туберкулеза (МБТ). Туберкулез – инфекционное заболевание, которое отличается преимущественно хроническим течением различных клинических форм, своеобразием специфических иммунологических и морфологических проявлений. Однако проникновение в организм возбудителя туберкулеза является необходимым, но недостаточным условием для развития болезни. В патогенезе туберкулеза немаловажную роль играют так называемые способствующие факторы. К таким факторам относят некоторые свойства макроорганизма (пол, возраст, сопутствующие заболевания, общая реактивность организма и т.д.), вирулентность микобактерии туберкулеза и массивность инфицирования, а также воздействие внешней среды (неблагоприятная микросоциальная среда, социально-гигиенические факторы и низкий экономический уровень жизни), при котором происходит инфицирование. Иногда роль сопутствующих факторов в этиологии туберкулеза выступает на первое место [Давыдовский И.В., 1962].

Несомненно, что семейное накопление туберкулеза обусловлено общностью внешнесредовых факторов, воздействующих на каждого члена семьи. Но даже в условиях тесного семейного контакта с бактериовыделителем не все члены семьи заболевают туберкулезом. Если проследить историю взаимодействия человеческой популяции с возбудителями инфекционных болезней, то можно заметить, что эпидемии особо опасных заболеваний не заканчивались полным вымиранием. Выживали индивиды - возможно, носители определенных генетических систем, имеющих отношение к сопротивляемости соответствующим инфекциям [Хоменко А.Г., 1990].

Туберкулез отличается клиническим полиморфизмом, что проявляется различными формами заболевания – от малых с бессимптомным течением до обширных деструктивных процессов в легких с выраженной клинической картиной, а также наличием туберкулезного процесса различной локализации в других органах [Пузик В.И. и др., 1973]. По-видимому, причины такого разнообразия проявлений туберкулеза могут определяться не только неблагоприятным сочетанием внешних факторов, но и внутренними, наследственными причинами.