Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 5)

Однако известно, что действие продукта экспрессии гена рецептора витамина D оказывает умеренное влияние на полную чувствительность к туберкулезу [Hill A.V.S., 2001]. К тому же, роль кальцитриола в антибактериальном иммунитете не однозначна, поскольку он наряду с активизацией макрофагов проявляет такие эффекты, как угнетение пролиферации лимфоцитов, снижение продукции иммуноглобулина и синтеза цитокинов [Bellamy R., Hill A.V.S., 1998; Wilkinson R. J. et al., 2000].

В целом, можно отметить, что в настоящее время имеется достаточно разрозненная информация о генетических основах подверженности к туберкулезу, а так же, видимо, общее количество генов, в той или иной мере влияющих на развитие этого инфекционного заболевания, гораздо выше. Таким образом, поиск новых генов-кандидатов туберкулеза, а так же изучение полиморфизма известных генов-кандидатов в популяциях различного этнического состава и их вклада в общую подверженность к заболеванию представляется на сегодняшний день важной задачей, решение которой позволит определить новые подходы к более эффективному лечению и профилактике ТБ.

2. Материал и методы исследования

2.1 Обследованные группы населения

Настоящее исследование включало три аспекта: анализ популяционной распространенности полиморфизма генов NRAMP1, VDR, IL1B, IL1RN и IL12В, оценку их патогенетической значимости в отношении туберкулеза, а также влияние исследуемых генов на патогенетически важные параметры заболевания. В соответствии с этим, первую часть работы выполнили на материале популяционной выборки здоровых жителей г. Томска (140 человек). Вторая и третья часть исследования проведена на материале выборки больных туберкулезом (304 человека) и их семей (42 семьи, 109 человек), живущих в г. Томске и Томской области.

Работа выполнена на базе ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава и ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН. Набор материала для исследования осуществлялся в Областной Томской клинической туберкулезной больнице, Детском легочно-туберкулезном отделении Железнодорожной больницы, Областной детской туберкулезной больнице, а также Областном противотуберкулезном диспансере, в соответствии с этическими нормами с обязательным получением согласия испытуемых.

2.1.1 Характеристика контрольной выборки

В качестве контрольной группы использовалась популяционная выборка, сформированная для настоящего исследования на основе ДНК–банка ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН. Все лица, вошедшие в эту группу, были русскими. Основным критерием отбора образцов было отсутствие родства между индивидами. В данную выборку вошли индивиды никогда не болевшие туберкулезом по анамнестическим данным (140 человек), средний возраст которых составил 61,819,4 лет. Частично ее составили индивиды (118 человек) не родственные между собой и не имеющие по результатам клинического и параклинического обследования легочной патологии. Остальная часть контрольной группы (22 человека) включала пациентов, которым первоначально ошибочно был выставлен диагноз туберкулеза, но затем при более детальном обследовании данное заболевание было исключено. Таким образом, этих индивидов можно считать здоровыми от ТБ.

2.1.2 Характеристика выборки больных туберкулезом

Исследованная выборка больных туберкулезом была сформирована из индивидов, не родственных между собой. Выборка была однородной как по расовой принадлежности, так и по этническому происхождению, средний возраст составил 30,615,4 года. Все пациенты были русскими; женщин – 99 (32,6%), средний возраст которых составил 26,3 14,6 года, мужчин –205 (67,4%), средний возраст – 32,8 15,4 лет.

Диагноз туберкулеза легких устанавливался на основании данных микроскопии мокроты с обязательным рентгенологическим исследованием легких для определения формы заболевания и распространенности специфического процесса (общепринятые методы).

Обследованные пациенты имели следующие клинические формы туберкулеза: у 43 человек был диагностирован первичный туберкулез (у 35 – туберкулез внутригрудных лимфоузлов, у 3 – первичный туберкулезный комплекс, у 2 – плеврит туберкулезной этиологии первичного периода, у 2 – гематогенно-диссеминированный туберкулез легких), 150 пациентам был поставлен диагноз инфильтративного туберкулеза легких, 65 – диссеминированный туберкулез легких, 27 пациентам – очаговый туберкулез, у пятерых обследованных индивидов развилась казеозная пневмония, у 4 – фиброзно–кавернозный туберкулез легких, такому же количеству больных был выставлен диагноз туберкуломы легких, 3 пациентам – туберкулез почек, 2 – туберкулез бронха, 1 – плеврит туберкулезной этиологии.

2.1.3 Характеристика семейной выборки пробандов, больных туберкулезом

Исследованная семейная выборка была зарегистрирована по пробандам – больным туберкулезом, находившихся на лечении в противотуберкулезных учреждениях г. Томска в период с 2000 по 2004 г. Всего было обследовано 42 семьи (109 человек), в том числе 25, зарегистрированных по пробандам – детям в возрасте от 1 года до 15 лет. Семнадцать семей было выбрано по взрослым пробандам в возрасте от 17 до 48 лет (табл. 3).

Таблица 3 Структура семейного материала выборки изученной по полиморфным ДНК-маркерам генов NRAMP1, VDR, IL1B, IL12B, IL1RN

Выборка	Количество детей в семье					Всего
	1	2	3	4	5
Полные семьи (изучены оба родителя и дети)	19(57)	0	0	0	1(7)	20(64)
Неполные семьи (изучен один родитель и дети)	16(32)	1(3)	0	0	0	17(35)
Нет данных о родителях	0	5(10)	0	0	0	5(10)

Примечание. В скобках указано количество индивидов.

Часть пробандов–детей составили мальчики (n=10), а девочек было в 1,5 раза больше (n=15). Средний возраст пробандов–детей разного пола достоверно не различался (7,2 года у мальчиков и 7,5 лет у девочек). Среди взрослых пробандов было 7 женщин (средний возраст – 19,8 лет) и 10 мужчин (средний возраст – 23,9 лет). Всем пробандам был поставлен диагноз туберкулеза, причем первичный и вторичный генез заболевания встречался с одинаковой частотой. Среди обследованных родственников пробандов первой степени родства было 28 лиц мужского пола, из них 8 человек болели туберкулезом, и 39 -женского, из них с туберкулезом 14.

2.2 Методы исследования

2.2.1 Клинико-лабораторные методы исследования

Клинико – эпидемиологический анализ больных туберкулезом включал: возраст начала заболевания, социальную категорию, вредные привычки (курение, злоупотребление алкоголем, употребление наркотиков), сопутствующую патологию, наличие контакта с туберкулезным больным, а также данные о туберкулезе у родственников больного. Анализу подвергались выраженность клинических проявлений (жалобы, объективный статус больного), результаты лабораторных и инструментальных методов исследования (микроскопия и посев мокроты на МБТ, чувствительность к противотуберкулезным препаратам, рентгенологическое исследование легких, общий анализ крови) на момент начала заболевания.

Для решения задачи по оптимизации и стандартизации сбора информации о больном ТБ была разработана специальная карта "Унифицированный носитель информации", содержащая блоки, охватывающие сведения о жалобах больного, эпидемиологическом анамнезе, анамнезе заболевания, объективном статусе, результатах лабораторного и инструментального обследования. В дальнейшем на основании сведений из этих карт была создана электронная база данных в формате Microsoft Excel.

2.2.2 Молекулярно – генетические методы анализа полиморфизма генов

Всего было изучено 9 полиморфных вариантов пяти генов – кандидатов подверженности туберкулезу. Исследовали 4 полиморфных варианта гена NRAMP1: 469+14G/C (INT4) – трансверсия гуанина на цитозин в 4 интроне, С274Т – консервативная замена в 3 экзоне, 1465-85 G/A – транзиция в 13 интроне и D543N – неконсервативная замена цитозина на аденин в 15 экзоне; два полиморфизма VDR гена: B/b, F/f; полиморфный вариант IL1B гена в 5 экзоне +3953А1/А2; VNTR полиморфизм гена IL1RN, расположенный во 2 интроне. Также выборки генотипировали по полиморфизму гена IL12В, обусловленному трансверсией аденина на цитозин в 3`-UTR области (табл. 4).

Для генотипирования индивидов по указанным полиморфизмам использовали образцы тотальной ДНК, выделенной из цельной венозной крови по стандартной неэнзиматической методике [Маниатис Т. и др., 1984; Lahiri D. et al., 1992]. Выделенную ДНК замораживали и хранили при температуре -20 С до проведения эксперимента. Генотипирование осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе (табл.5).

Смесь для ПЦР содержала 0,5-2,0 мкл специфической пары праймеров с концентрацией 1 о.е./мл, 1,2-1,8 мкл 10 буфера для амплификации с концентрацией MgCl₂ 0,5-2,0 mM, 0,5-1,0 е. а. Taq ДНК-полимеразы ("Сибэнзим", "Медиген", Новосибирск) и 100-200 нг геномной ДНК. Смесь помещали в 0,5 мл пробирки типа "Эппендорф", наслаивали сверху минеральное масло для предотвращения испарения и амплифицировали в автоматических минициклерах "MJ Rеsearch" (США) и "БИС 108" (Россия-Новосибирск).

Программа амплификации включала предварительную денатурацию при 94С в течении 5 минут, с последующими 30-35 циклами отжига при температуре 60С (1мин.), элонгации цепи при 72С (40 сек.) и денатурации при 94С (40 сек.). Программу завершала финальная элонгация при 72С в течение 3 минут. Амплификат подвергали гидролизу соответствующей рестриктазой (табл.5) при оптимальной для фермента температуре в течении 12-24 ч. Рестрикционная смесь включала 5-7 мкл амплификата, 1,0-1,2 мкл 10 буфера для рестрикции, поставляемого фирмой – производителем ("Сибэнзим", Новосибирск), и 1-5 единиц активности фермента (в зависимости от эффективности его работы). Продукты рестрикции фракционировали в 3% агарозном геле при напряжении 120 В в течении 30 минут. Фрагменты ДНК окрашивали бромистым этидием и визуализировали в ультрафиолетовом свете.

Таблица 4Структура материала популяционных выборок г. Томска и Томской области, изученных по полиморфным ДНК-маркерам генов NRAMP1, VDR, IL1B, IL12B, IL1RN

Ген	Полиморфизм	Выборка больных туберкулезом	Выборка здоровых индивидов
NRAMP1	469+14G/C	279	137
	D543N	278	139
	1465-85G/A	279	135
	274C/T	299	116
IL12B	1188А/С	279	129
VDR	B/b	293	108
	F/f	298	113
IL1B	+3953A1/A2	301	139
IL1RN	VNTR	299	140

Таблица 5 Характеристики исследованных полиморфизмов

Ген	Полимор-физм	Структура праймеров	tо отжига прай-меров, оС	Фермент рестрик-ции	Продукты гидролиза, п. н.					Литература
					Аллель «дикого» типа			Мутантный аллель
N 48 RAMP1	274C/T	5’-tgccaccatccctatacccag –3’ 5’-tctcgaaagtgtcccactcag –3’	60	Mnl I	167;37;12 bp			102;65;37;12 bp		Liu J. et al., 1995
	469+14G/C	5’-tctctggctgaaggctctcc –3’ 5’-tgtgctatcagttgagcctc – 3’	60	Apa I	624 bp			455;169 bp
	1465-85G/A	5’-gcaagttgaggagccaagac –3’ 5’-acctgcatcaactcctcttc –3’	60	Bsе 1I	142;75;24 bp			102;75;40;24 bp
	D543N	5’-gcatctccccaattcatggt –3’ 5’-aactgtcccactctatcctg –3’	60	Bme 18I	126;79;39 bp			201;39 bp
IL12	A1188C	5’-ttctatctgatttgcttta –3’ 5’-tgaaacattccatacatcc –3’	43	Taq I	233 bp			165;68 bp		Hall M. A. еt al., 2000
VDR	B/b	5’-aacttgcatgaggaggagcatgtc-3’ 5’-ggagaggagcctctgtcccatttg-3’	60	Pct I		813 bp	505;308 bp			Wilkinson R.J. et al., 2000
	F/f	5’-agctggccctggcactgactctgctct-3’ 5’-atggaaacaccttgcttcttctccctc-3’	60	Fok I		267 bp	197;70 bp
IL1B	+3953A1/A2	5’-gttgtcatcagactttgacc-3’ 5’-ttcagttcatatggaccaga-3’	58	Taq I		220 bp	148; 72 bp			Wilkinson R.J. et al., 1999
I 49 L1RN	VNTR	5’-tcctggtctgcaggtaa-3’ 5’-ctcagcaacactcctat-3’	60	А1-410 п.о. (4 повтора); А2-240 п.о. (2 повтора) А3-500 п.о. (5 повторов); А4-325 п.о. (3 повтора) А5-595 п.о. (6 повторов)					Tarlow J.K. et al., 1993

2.2.3 Генетико – статистические методы анализа

Характеристики

Список файлов ВКР