В работе [13] описан способ определения НДМГ методом НФ ВЭЖХ в виде производного с 4-нитробензальдегидом со спекторофотометрическим детектированием. В качестве неподвижной фазы применяется колонка Silasorb 300 с немодифицированным силикагелем в качестве сорбента. Подвижная фаза содержит 92.5% гексана, 7.5% этилацетата, 1000 мг/л бензойной кислоты. Бензойная кислота применяется в качестве модификатора, что приводит к улучшению разделения. Данная методика позволяет определять НДМГ в водах и почвенных вытяжках на уровне ниже ПДК.

Обращенно-фазовая ВЭЖХ в основном используется для разделения неполярных веществ. Хотя гидразин и его алифатические производные не являются сильно гидрофобными веществами, существуют работы, в которых их определяют в виде индивидуальных веществ.

Первой работой по определению гидразина и 1,1-диметилгидразина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии была статья Абдоу, Медвика и
Бейли [14]. Они предложили использовать для детектирования производные салицилового альдегида. При детектировании диметилгидразона салицилового альдегида при длине волны λ=293 нм достигается максимальная чувствительность определения при минимальном влиянии избытка альдегида. В качестве сорбента использовали обращенную фазу μBondpack C18. Разделение определяемых компонентов производили на колонке 30 см длиной и внутренним диаметром 4 мм. Подвижная фаза содержала ацетонитрил (52±2% по объему) и 0,14 М KH₂PO₄ (48±2% по объему). Метод не обладает достаточной чувствительностью. Минимальная определяемая концентрация составляла для гидразина 2 мкг/мл, а для несимметричного диметилгидразина – 5 мкг/мл.

Для улучшения чувствительности в работе [15] НДМГ определяли методом ОФ ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектором в виде гидразона 4-нитробензальдегида. Пара-нитробензальдегид был выбран по той причине, что ароматические соединения обладают высокими молярными коэффициентами поглощения. Определение НДМГ в виде гидразона подразумевает использование большого избытка реагента, так как скорость реакции и выход продукта увеличиваются в этом случае. Было установлено, что наилучшие результаты разделения достигаются на колонке Zorbax C8 (4,6×250 мм, 5 мкм). Максимум поглощения гидразонов сдвинут в более длинноволновую область по сравнению с исходным альдегидом и составляет 390–400 нм. Предел обнаружения НДМГ при объеме вводимой пробы 50 мкл составил 2.4 мкг/л.

В работах [16] были предложены методики определения гидразида изоникотиновой кислоты (изониазид) в молоке и биологических жидкостях с применением дериватизации коричным альдегидом. Было установлено, что достаточным для определения является 40 мкл 1% метанольного раствора коричного альдегида на 200 мкл образца. Разделение компонентов проводили на колонке Partecil 5 C8 (4,6 × 250 мм). Использовали градиентное элюирование смесью дигидрофосфат калия (50 мМ)–ацетонитрил–изопропанол (4:1). Детектирование осуществляли спектрофотометрически при λ = 340 нм. Для гидразина диапазон линейности градуировочной зависимости составил 10–400 мкг/л.

В работе [17] авторами предложен метод, основанный на применении жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием при определении продуктов трансформации несимметричного диметилгидразина в почвах: диметилгидразида муравьиной кислоты (определяемый диапазон составляет 0,01-20 мг/кг), 1-метил-1,2,4-триазола (определяемый диапазон составляет 0,05-100 мг/кг), 1,1-диметилгуанидина (определяемый диапазон составляет 0,05-100 мг/кг) и диметиламина (определяемый диапазон составляет 0,25-250 мг/кг). Для извлечения этих веществ из загрязненных почв использовали экстракцию метанолом (для ДГМК) и ультразвуковую экстракцию слабощелочным буферным раствором (для остальных соединений).

***

В литературе представлено значительное число работ, посвященных определению гидразина и его производных, в частности определению НДМГ. Применение хроматографических методов в анализе таких соединений является весьма распространенным и оправданным, тогда как спектроскопические методы не обеспечивают необходимой чувствительности и селективности. Среди хроматографических методов перспективно использование метода ОФ ВЭЖХ для определения гидразина и его производных напрямую, без проведения дериватизации, поскольку данный метод обладает высокой чувствительностью, селективностью и простотой реализации.

2. Экспериментальная часть

2.1. Реактивы и оборудование

В работе использовали следующие реактивы:

Ацетонитрил (HPLC grade, Panreac), 1,1-диметилгидразин (Aldrich, США), ацетат аммония (Roth, Германия), монометилгидразин («Merck», Германия), 1,1-метилэтилгидразин («Merck», Германия), гидразин сульфат (Aldrich, США), бутилгидразина оксалат (Aldrich, США), tert-бутилгидразина гидрохлорид (Aldrich, США), триметилгидразин (Aldrich, США), дистиллированная и деионизированная вода.

В работе использовалось следующее оборудование:

Система ВЭЖХ с амперометрическим детектированием, состоящей из насоса Стайер серия I (Аквилон, Россия), крана-дозатора с объёмом петли 100 мкл (Knauer, Германия) и амперометрического детектора «Цвет-Яуза», оснащенного стеклоуглеродным рабочим электродом. (НПО Химавтоматика, Россия). Амперометрическое детектирование осуществляли при потенциале рабочего электрода +1,3 В.

В работе использовали колонку ProntoSIL 200-5-C30 (120*2 мм), диаметр зерна сорбента 5 мкм (Bischoff Chromatography, Германия). Скорость подачи подвижной фазы - 0,5 мл/мин

Регистрацию хроматограмм проводили на персональном компьютере с помощью программного пакета Экохром (Россия).

Для измерения pH использовали иономер Sartorius PB-11 (Германия).

Для отбора точной аликвоты использовали автоматические дозаторы 10-100 мкл, 20-200 мкл, 100-1000 мкл с пределом допускаемой погрешности измерения не более ± 5% (LABMATE, Польша).

Для проведения ультразвуковой жидкостной экстракции использовали ультразвуковую ванну УЗВ (ПКФ Сапфир, Россия).

Взвешивание точных навесок проводили на весах Explorer Pro (Ohaus Corporation, США), точность которых 0,0001 г.

Для центрифугирования образцов использовали центрифугу Elmi CM-50 (Латвия).

2.2. Техника эксперимента

Для приготовления стандартных растворов исследуемых гидразинов с концентрацией 1000 мг/л точные навески растворяли в дистиллированной воде и хранили в холодильнике не более 4х недель. Рабочие растворы готовили непосредственно перед анализом разбавлением аликвот стандартного раствора в колбе на 100 мл. Растворы доводили до метки дистиллированной водой.

Подвижные фазы готовили с использованием деионизированной воды и последующей дегазацией на роторном испарителе в день проведения анализа.

Приготовление водных вытяжек почв. Навеску образца почвы 2,00 г помещали в пластиковую градуированную пробирку типа «Фалькон» емкостью 50 мл, добавляли 20 мл водного раствора ацетата аммония концентрацией 100 мМ, закрывали штатными завинчивающимися крышками. Полученные образцы помещали в ультразвуковую баню на 1 час. Затем отбирали аликвоту, центрифугировали её при 16000G в течение 4 минут.

3. Обсуждение результатов

В рамках данной работы была поставлена задача нахождения оптимальных условий разделения смеси гидразинов (гидразин, метилгидразин, бутилгидразин, tert-бутилгидразин, НДМГ, метилэтилгидразин, триметилгидразин) методом ОФ ВЭЖХ. Для достижения поставленной задачи в методе ОФ ВЭЖХ следует определить влияние на характеристики разделения таких хроматографических параметров, как природа подвижной и неподвижной фаз, ионная сила, pH и выбрать оптимальные условия для одновременного разделения вышеуказанных веществ.

Для разделения был выбран метод обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с амперометрическим детектированием. Для данного метода характерны доступность оборудования, экспрессность, высокая чувствительность и селективность, кроме того, не требуется стадия дериватизации, что значительно сокращает время исследования и упрощает методику. А амперометрический детектор (как было показано в обзоре литературы) является наиболее чувствительным к производным гидразина. Детектирование проводилось при постоянном напряжении 1300 мВ. Данной значение является оптимальным, так как при увеличении напряжения начинается окисление растворителя (воды), что, в свою очередь, увеличивает фон, в то же время при этом потенциале окисляются все из исследуемых гидразинов.

Скорость подачи подвижной фазы выбрали 0,5 мл/мин, поскольку диаметр колонки составлял 2 мм и это значение является оптимальным для колонок такого диаметра.

Особенностью данной работы является использование колонки ProntoSIL 200-5-C30. Данная колонка рекомендуется производителем для анализа растительных экстрактов, пищевых и биологических тканей, которые содержат структурно различные каротиноиды и смеси геометрических изомеров. Сорбент представляет собой силикагель, модифицированный длинными алкильными цепями С30. Колонка характеризуется высокой воспроизводимостью результатов, высокой эффективностью, широким диапазоном линейности, малой чувствительностью к составу пробы и минимальным влиянием матрицы на воспроизводимость свойств, высокой селективностью, устойчивостью в диапазоне значений pH от 1 до 7 (в щелочной среде возможен гидролиз сорбента). Для наилучшей стабильности колонка должна работать при комнатной температуре и ниже, поэтому можно не использовать термостат колонок, что значительно упрощает конструкцию прибора.

В ходе исследования варьировали значение pH подвижной фазы. Так как гидразины обладают кислотно-основными свойствами (pK_b~7), то при уменьшении pH элюента следует ожидать уменьшение времен удерживания за счет значительного увеличения доли протонированных форм компонентов, которые меньше взаимодействуют с сорбентом, чем непротонированные формы. В то же время следует учитывать, что колонка дает стабильные результаты только при pH меньше 7. Для исследования были выбраны следующие значения pH: 6,8; 5,4 и 4,4 (для создания необходимого значения pH использовался ацетат - аммонийный буфер). Объемная доля ацетонитрила оста валась постоянной и равной 0,2.

Таблица 5. Результаты исследования зависимости времен удерживания и эффективности от значения pH элюента при постоянной объемной доле ACN (F=0,5 мл/мин)

Оказалось, что при низких значениях pH компоненты удерживаются слабо и выходят практически с мертвым временем (табл. 5). Из таблицы видно, что при уменьшении pH элюента увеличивается эффективность определения, такая тенденция объясняется подавлением дополнительных механизмов удерживания (ионообменные взаимодействия с силанольными группами) при уменьшении pH, поскольку диссоциация силанольных групп подавляется при уменьшении рН элюента. Но при pH 6,8 наблюдали лучшее разделение веществ из-за более высокой селективности, поэтому в дальнейших исследованиях использовали именно это значение pH.

В ходе работы также исследовали зависимость времен удерживания и эффективности от состава подвижной фазы: варьировали объемную долю ацетонитрила и содержание электролита в растворе (табл. 6 и 7).