1 (Жаров В.П., Жорина Л.В., Змиевской Г.Н. - Изучение фотодинамического действия света на клеточные структуры), страница 3

Правильное построение дозовых кривых для ФДЭ должно содержать: а) выбор концентрации эритроцитов в суспензии в соответствии с исходным пропусканием образца в пределах Т = 2030%, чтобы диапазон изменения пропускания при гемолизе эритроцитов был велик по сравнению с исходной величиной пропускания; б) выбор концентрации ФС, достаточно большой для обеспечения полного поражения всех эритроцитов в образце, но при этом достаточно малой для того, чтобы исходное пропускание образца с добавленным ФС не сильно отличалось от несенсибилизированного (т.е. находилось в пределах тех же 2030%); в) обязательное измерение характеристик контрольного образца, выдерживаемого параллельно с облучаемым в темноте, с тем, чтобы выделять при каждом измерении ту оптическую плотность, которая определяется именно ФДЭ, а не всеми прочими причинами. Основной серии измерений, позволяющих построить дозовую кривую, должны предшествовать 2 серии предварительных измерений: а) спектральной характеристики пропускания суспензии эритроцитов (несенсибилизированной); б) спектральной характеристики пропускания раствора ФС. Эти кривые позволяют определить как предпочтительную длину волны источника засветки, так и длину волны, на которой следует вести измерения Т и Д для наиболее заметного проявления ФДЭ. Очевидно, что первая должна быть близка к максимуму поглощения ФС, вторая – к максимуму экстинкции суспензии эритроцитов. Доза облучения (в относительных единицах) определяется посредством измерения времени облучения. В качестве контрольного, как в начале, так и по окончании опыта, следует провести измерение плотности потока излучения (освещенности), даваемой используемым источником. Это необходимо для того, чтобы можно было считать зависимость дозы D облучения от времени t линейной (обеспечение линейности, согласно формулам (13) и (5), имеет место только при I₀ = const).

Выполнение работы.

7. Используемое оборудование и материалы.

1. Колориметр фотоэлектрический КФК-2.

2. Источники света: осветитель эндоскопический ОС-150 со световодным кабелем; светодиодная матрица с набором светодиодов, излучающих в красной области спектра; коллимированный источник света на базе лампы накаливания, используемый в микроскопии и для экспериментов на оптической скамье.

3. Люксметр (любой из выпускаемых промышленно, имеющий диапазон измерения освещенностей до 10⁵ лк).

4. Микроскоп лабораторный с увеличением порядка 400-500 (безыммерсионный).

5. Штатив для установки образцов в процессе облучения или оптический столик из комплекта оптической скамьи.

6. Прямоугольные кюветы, пробирки, пипетки, протирочный материал (тонкая ткань, вата), спирт.

7. Физиологический раствор.

8. Фотосенсибилизаторы (ФОТОГЕМ, ФОТОСЕНС).

9. Ингибитор: гипосульфит (тиосульфат) натрия, в кристаллах.

10. Образцы крови (предлагаются преподавателем для исследования на основании лабораторных анализов поликлиники).

11. Дистиллированная вода.

Примечание: для исследования преподавателем может быть предложен новый тип ФС или ингибитора, а также различные образцы крови.

Приложение к работе содержит, кроме описания и математической модели, правила порядка эксплуатации приборов и оборудования и методику работы с биологическими препаратами.

8. Порядок выполнения работы.

1. Изучить описание методики измерений, проанализировать схему эксперимента и порядок работы с измерительной аппаратурой (колориметр, люксметр, микроскоп, источник излучения).

2. Подготовить ответы на контрольные вопросы.

3. Приготовить растворы ФС в дистиллированной воде, снять необходимые характеристики пропускания растворов с помощью колориметра (Т = 6070%). Поместить заготовленные растворы в темноту.

4. Приготовить суспензию эритроцитов нужной концентрации путем разбавления предложенного образца крови физраствором (Т = 2030%). Предпочтительнее использовать кровь с введенными консервантами (гепарин и др.) для повышения стабильности ее оптических характеристик. Снять спектральную характеристику пропускания приготовленной суспензии и выделить оптимальную длину волны для наблюдения ожидаемого ФДЭ.

5. Приготовить с каждым из ФС не менее 3 проб (контрольная – темновая, 2 пробы ФС + эритроциты (одна проба облучается сразу, другая после инкубации), ФС + эритроциты + ингибитор). Зафиксировать время приготовления одной из проб ФС+эритроциты для дальнейшего подсчёта времени инкубации. Инкубация проводится для накопления ФС в клетке. Время инкубации ФС ФОТОГЕМ должно составлять не менее получаса ФС ФОТОСЕНС - около часа. Поместить все образцы в темное место (лабораторный шкаф).

6. Измерить начальную плотность всех проб с помощью колориметра.

7. Произвести визуальный контроль всех проб с помощью микроскопа. Зарисовать результаты наблюдений с указанием характерных размеров эритроцитов и других наблюдаемых микрообъектов.

8. Измерить плотность потока выбранного источника излучения. Начать облучение одного из образцов ФС + эритроциты, выбрав время облучения перед первым измерением не более 0,5 минут. Производить измерения оптической плотности и пропускания образцов после каждого облучения, постоянно держа необлучаемые в данный момент образцы в темноте. При каждом измерении производить визуальный контроль состояния эритроцитов через микроскоп. Каждое измерение должно быть выполнено не менее 5 раз для расчёта среднего значения и среднеквадратичной ошибки измерения. При появлении эффекта (изменении оптической плотности образца) измерения вести каждую минуту. После окончания серии измерений (выхода на плато оптической плотности) произвести повторный контроль освещенности. Данные измерений занести в таблицу.

9. Сравнить полученные экспериментальные результаты с теоретической зависимостью, рассчитанной по формуле (5). Построить графики всех полученных экспериментальных кривых.

10. Выполнить пункты 4 - 8 с каждым из предложенных преподавателем ФС. Оценить по данным измерений дозу облучения, полученную каждым из облученных образцов.

11. Составить описание проделанных согласно п.3-10 действий и анализ полученных результатов.

9. Контрольные вопросы.

1. Описать последовательность передачи энергии возбуждения при ФДЭ от света к окисленному субстрату. Что произойдет, если:

а) квантовый выход интерконверсии для двух выбранных ФС составляет в одном случае 0,01, в другом – 0,9? Следует ли вообще отказаться от ФС с _ик = 0,01, или его все же можно использовать? Для какой цели?

б) преобладает не химическое, а физическое тушение? Следует ли отсюда, что дозовая кривая вообще выродится в прямую , или нет? Как в лабораторных условиях оценить вклад физического механизма тушения для реальных ФС?

2. Как известно, триплетные уровни могут испытывать расщепление в магнитном поле. Исходя из этой возможности, описать возможность управления ФДЭ с помощью наложения внешнего магнитного поля («магнито-лазерная ФДТ»?)

3. Имеются 2 источника излучения засветки типа ОС-150 (некогерентный источник света с квазисплошным спектром). В одном случае для облучения образца сенсибилизированных клеток используется оптическая система зеркального типа (коллимация пучка с помощью отражения от зеркального покрытия, одинаково отражающего все длины волн, испускаемые источником), в другом – световодный кабель из волокна, обрезающего излучение ИК диапазона (  1,5 мкм). В области максимума поглощения ФС интенсивности облучения одинаковы («активные дозы» совпадают). В каком из рассматриваемых случаев следует ожидать более сильного ФДЭ?

4. Имеется возможность наблюдать ФДЭ в описанной схеме измерений с помощью фотоколориметра на двух длинах волн: желтого диапазона (преобладает поглощение) и красного (преобладает рассеяние). Исходные коэффициенты экстинкции одинаковы. Какую из длин волн следует предпочесть для более отчетливого наблюдения ФДЭ?

5. Имеются 2 типа ФС: эндогенный и экзогенный (первый лучше проникает через мембрану эритроцита). Как по характеру дозовых кривых определить, где какой ФС?

Приложение 1.

Математическое описание ФДЭ.

В соответствии со схемой (1) реакций, идущих при ФДЭ, обозначим: [P] ,[P_s*], [P_T*] - молярные концентрации основного, синглетного и триплетного возбужденных состояний ФС соответственно; [³O₂], [¹O₂*] - то же для основного и синглетного возбужденного состояний молекулы кислорода; k_f и k_q – константы люминесцентного распада состояний S* и T* ФС соответственно; k_r - константа скорости интерконверсии; k₁ - константа скорости образования ¹O₂* ; k₂ - константа окисления субстрата; k₃ - константа распада состояния ¹О₂* всеми остальными путями, кроме окисления субстрата; k₄ - константа возможного восстановления окисленного субстрата.

Тогда система кинетических уравнений для молярных концентраций соответствующих веществ запишется так:

(П1)



 

Рис. 10. Блок-схема взаимных превращений клеточных состояний при фотодинамическом поражении клеток.

Можно показать, что скорость протекания первых трех процессов велика по сравнению с последним. Предположим также, что k₁[³O₂] » k_q ,т.е. отсутствует «кислородное голодание». Тогда для концентрации синглетного кислорода можно записать:

(П2)

Здесь - квантовый выход интерконверсии.

Подставляя (3) в последнее уравнение системы (2), а также вводя безразмерные переменные , где за R₀ обозначена суммарная концентрация субстрата [R] + [RH₂], получим:

(П3)

Уравнение (П3) описывает динамику окисления субстрата. Свяжем этот процесс с процессом гибели клеток, содержащих ФС. Будем считать, что скорость повреждения клеток пропорциональна доле окисленного субстрата, а скорость репараций – доле неокисленного субстрата. При этом существует постоянная вероятность необратимой гибели поврежденных клеток. Блок-схема взаимных превращений клеточных состояний показана на рис.10, где буквами , ,  обозначены удельные скорости переходов клеток из соответствующих состояний. Система дифференциальных уравнений, соответствующих схеме рис.7, будет иметь вид:

(П4)

Уравнение (П3) вместе с системой (П4) образуют замкнутую модель поражения патологических клеток, в которой параметры G и K являются управляющими. Константа G пропорциональна исходной концентрации препарата и интенсивности излучения. Очевидно, G  0 только на время экспозиции (облучения) Т₀ , т.е. G = 0 при t  T₀ . Введем безразмерные переменные и параметры для системы (4)-(5), а также безразмерное время:

(П5)

Окончательно модель ФДЭ описывается системой трех дифференциальных уравнений, если учесть, что (z – доля неокисленного субстрата). При этом условие Y₂ =0 в (П4) можно заменить условием сохранения полного числа клеток X + Y₁ +Y₂ = X₀

(П6)