1 (Жаров В.П., Жорина Л.В., Змиевской Г.Н. - Изучение фотодинамического действия света на клеточные структуры), страница 2

Плоское строение позволяет молекулам ГП - I при высоких концентрациях образовывать агрегаты в виде «столбиков монет». Эта агрегация приводит к смещению максимумов в спектре поглощения, к тушению флуоресценции ГП - I и не позволяет использовать его для диагностики, а также снижает его эффективность при фотодинамическом воздействии (ФДВ). Это говорит о важности применения правильной концентрации ГП - I для ФДТ. С другой стороны, преимущественное накопление ГП - I в опухолях неизбежно приведёт к агрегации ФС. Таким образом, с этой точки зрения ГП - I не является «идеальным» ФС для ФДТ.

Агрегировать в виде «столбика монет» AlФцS₄ мешает атом Al, который выходит из плоскости макроцикла, поэтому агрегаты AlФцS₄ образуются соединением молекул в одной плоскости. Агрегация AlФцS₄ также приводит к тушению его флуоресценции, однако, при большей концентрации, чем у ГП - I.

По своим растворимым свойствам ГП - I гидрофобен, т.е. практически нерастворим в воде и обладает большим сродством к липидам. Поэтому ГП - I при накоплении локализуется в мембранах клетки и внутриклеточных органелл.

AlФцS₄ гидрофилен, т.е. при накоплении в клетке он должен локализоваться в водной фазе: цитоплазме, лизосомах и других органеллах. Однако, процесс накопления этого ФС в клетках идёт значительно медленнее, чем для ГП - , т.к. мембрана клетки и внутриклеточных органелл является существенной преградой липофобного AlФцS₄. Кроме того, молекула этого ФС, также как и ГП - I, является достаточно большой и не может проникнуть в клетку путём простой диффузии.

Поскольку ПГП - I накапливается в мембранах и трудно переходит в водную фазу, он очень медленно выводится из организма. Гидрофильные же свойства AlФцS₄ позволяют ему быстро выводиться из организма, что является его очередным преимуществом перед ПГП - I.

4. Выбор длины волны излучения при ФДТ.

Идеальным является случай, при котором максимум поглощения ФС совпадает с максимумом спектральной плотности источника света. К сожалению, это на практике удается реализовать далеко не всегда (даже если in vitro желаемое совпадение достигнуто, введение препарата in situ, как правило, изменяет положение максимума поглощения ФС малопредсказуемым образом). Поэтому используется либо перестраиваемый в широком диапазоне лазер (на красителе), либо мощный широкополосный источник (кварц-галогенная или ртутная лампа). В последнее время большой интерес вызывают источники на светодиодах, монохроматичность которых значительно выше, чем для ламп, хотя и гораздо ниже, чем для лазеров. На рис.5 представлены характерные спектры поглощения для растворов препаратов ФОТОГЕМ и ФОТОСЕНС в сопоставимых концентрациях. Видно, что наиболее изученные и широко применяемые в медицинской практике препараты на основе ПГП обладают далекими от оптимальных спектральными характеристиками. В самом деле, самый интенсивный пик поглощения препарата ФОТОГЕМ расположен в районе 400 нм, т.е. там, где мягкие биоткани, ввиду их существенной кровенаполненности, очень плохо пропускают электромагнитное излучение. Характерная глубина проникновения здесь не превышает 1 мм, что не позволяет проводить ФДТ для имеющих практическое значение слоев биоткани. Самый же длинноволновый пик поглощения, расположенный в области достаточно высокой прозрачности биотканей (625-630 нм), является настолько слабым, что требует высоких уровней интенсивности облучения (пороговое значение потока составляет около 50 мВт/см², что требует обеспечить выходную мощность лазера порядка 0,5-1 Вт), а также больших концентраций препарата, что может оказаться нереализуемым ввиду его достаточно высокой токсичности. Это заметно сужает сферу практических применений препаратов порфириновой группы. Препарат ФОТОСЕНС имеет основной (самый интенсивный) пик поглощения в районе 660-670 нм. Это позволяет снизить пороговую плотность потока излучения примерно на порядок по сравнению с препаратом ФОТОГЕМ. Тем самым открывается возможность проведения эффективной ФДТ с применением светодиодных источников, поскольку в этом диапазоне спектра имеются интенсивные облучатели данного типа (рис.5) Типичное значение выходной мощности светодиода на основе GaAl_0,35As (МГДС-структура) составляет 1 мВт в непрерывном режиме при токе через p-n переход 10 мА, при этом ширина спектра излучения при максимуме в районе 660  10 нм не превышает 60 нм (на уровне 0,5). При угловой ширине пучка излучения (на уровне 0,5) 50  10⁰ это дает силу света порядка 5 мКд. Достижение плотности потока порядка 10 мВт/см² вполне возможно при матричном исполнении светодиодного облучателя и применении оптической системы, собирающей выходной пучок в пятно диаметром порядка 1 см.

Применение препарата ФОТОСЕНС на практике уже показало, что с его помощью можно успешно лечить такие заболевания, которые ранее не считались доступными для ФДТ. Прежде всего – это заболевания желудочно-кишечного тракта, урологические, гинекологические. Имеются весьма обнадеживающие результаты в лечении рака молочной железы, предстательной железы и даже печени, при котором препараты на основе ПГП совершенно не эффективны. Однако, поскольку ФОТОСЕНС применяется пока относительно недолго, настоящая оценка его эффективности еще впереди. Механизм его действия, заметно отличный от препарата ФОТОГЕМ, изучен еще

совершенно недостаточно. Это, с одной стороны заставляет проявлять известную осторожность при рекомендациях, с другой стороны – в процессе исследований открываются новые возможности использования препарата. В частности, он оказывается эффективным средством против особо стойких бактерий и вирусов, которые не поддаются даже самым сильным антибиотикам. Этот обозначает новые горизонты как в лечении традиционных тяжелых инфекционных заболеваний, так и в поисках методов лечения СПИД.

Учитывая достижения лазерной техники, волоконной оптики, информатики и вычислительной техники, можно построить блок-схему современной установки для ФДТ, реализуемой в комплексном оснащении специализированных кабинетов (рис.6).

Рис.6. Блок-схема современной установки для ФДТ: 1- пациент, 2 – врач-оператор, 3 – ЭВМ, 4 – цифро-аналоговый преобразователь, 5 – лазер, 6 – система управления лазером, 7 – оптическая система, 8 – видеоконтрольная аппаратура, 9 – система управления видеоконтрольной аппаратурой.

5. Экспериментальное моделирование ФДЭ.

При выборе модели для лабораторного исследования ФДЭ внимание в первую очередь привлекает кровь. В самом деле, гемоглобин – белок, ответственный за транспорт кислорода от легких ко всем клеткам и тканям организма – сосредоточен в эритроцитах – главной составной части крови. В 1 мм³ крови содержится  510⁶ эритроцитов, их суммарный объем превышает объем следующих за ними по присутствию в крови телец (лейкоцитов и тромбоцитов) примерно в 50 раз. Эритроцит представляет собой дискоцит (тор без отверстия) со средним диаметром  8 мкм, наименьшей толщиной (в центре)  0,91 мкм и толщиной «бублика»  1,72,4 мкм (рис.7). Отметим, однако, что такая геометрия присуща эритроциту только в изотоническом растворе (рис. 7,а). Поскольку эритроцит не содержит ядра и его свойства определяются внешней мембраной, форма (а, следовательно, и соотношение между объемом и внешней поверхностью) эритроцита существенно зависят от осмотического давления (рис7,б,в).

Рис. 7. Геометрия эритроцита в различных условиях: а) в изотоническом растворе, б) при осмотическом давлении 217 мОсм/л, в) при осмотическом давлении 130 мОсм/л.

Тем самым величина осмотического давления является параметром, определяющим ход транспорта газов через клетки и ткани, а с ним – и весь метаболизм клетки. Но присутствие ФС влияет как раз на мембранный транспорт, т.е. управляет осмотическим давлением. Одновременно ФС окисляет гемоглобин, поскольку ключевым процессом для ФДТ является генерация и последующее химическое тушение синглетного кислорода. Таким образом, именно эритроциты первыми «принимают на себя» воздействие ФС. Под действием ФС происходит сначала изменение геометрии эритроцитов, затем их гемолиз - разрыв мембраны и гибель эритроцита как организованной формы кровяных телец. При этом, ввиду преобладания эритроцитов среди других элементов крови, оптические, механические и прочие свойства крови определяются в основном эритроцитами. Следовательно, при гемолизе следует ожидать радикального изменения оптических свойств крови (поглощения, рассеяния), выражающегося в изменении экстинкции среды. Этот факт, давно известный биологам, и закладывается в основу лабораторного моделирования ФДЭ. С оптической точки зрения, кровь представляет собой суспензию (взвесь) эритроцитов в практически прозрачной среде. Уже изменение формы эритроцита приводит к слабому, но вполне регистрируемому изменению спектра пропускания суспензии, поскольку рассеяние при сферуляции эритроцитов возрастает, а поглощение падает. Суммарная экстинкция оказывается минимальной при полной сферуляции эритроцитов. Полная же гемолизация крови приводит к резкому падению оптической плотности, причем количественное описание этого эффекта на сегодня в литературе отсутствует. Если, например, предположить, что при разрыве мембраны все молекулы гемоглобина оказываются в растворе и рассеивают как рэлеевские частицы (средний размер молекулы гемоглобина 11117 нм, т.е. наибольший поперечник мал по сравнению с длиной волны света), то такого резкого падения оптической плотности, как наблюдается в эксперименте, расчет не дает. Ряд гипотез, выдвигавшихся для объяснения этого эффекта, еще ждет своего экспериментального подтверждения. То, что в результате ФДЭ кровь из классической мутной среды (суспензия с большим рассеянием и поглощением) превращается в раствор, близкий к коллоидному, может быть взято за основу экспериментальной методики (рис.8).

Рис.8. Схема экспериментальная установки для наблюдения ФДЭ на взвеси эритроцитов: 1 – источник света, 2 – конденсор, 3.6.8 – диафрагмы; 4 – коллиматор; 5 – сменные интерференционные фильтры; 7 – кювета с исследуемой жидкостью; 9 – светоделительная пластинка; 10 – фотодиод; 11 – фотоэлемент; 12 – усилитель постоянного тока; 13 – измерительный прибор.

6. Экспериментальное оборудование, материалы и расчёты.

Экстинкция суспензии эритроцитов измеряется на фотоколориметре (приборе, измеряющем оптическую плотность на различных длинах волн). Используемый в лабораторной работе колориметр КФК-2 позволяет проделывать это на 9 длинах волн от 315 до 750 нм. Тем самым можно, хотя и грубо, но построить кривую спектра пропускания исследуемых жидких препаратов. Величина пропускания Т определяется отношением прошедшего через образец потока излучения I к падающему потоку I₀ , приведенными к одному и тому же поперечному сечению:

(2)

Для корректности определения Т оптическая схема колориметра содержит коллиматор и диафрагмы, обеспечивающие квазипараллельность проходящего через образец пучка излучения. Поскольку как спектральная интенсивность источника, так и спектральная чувствительность приемника зависят от длины волны, в приборе используется калибровочный канал, в который помещается кювета, заполненная растворителем (в данном случае, физраствором, оптическая плотность которого в рассматриваемом интервале длин волн мало отличается от водяной). Измерение Т на каждой длине волны производится в 2 приема: сначала в луч вводится калибровочная кювета, и с помощью регулировки чувствительности приемного канала показания прибора устанавливаются на Т = 1 (шкала отградуирована в процентах). После этого прибор переключается на измерительный канал (калибровочная кювета выводится из луча и точно на ее место помещается измерительная кювета с испытуемой жидкостью). При правильной калибровке (100% пропускания при открытом окне фотоприемника и 0% при закрытом) показания прибора дают величину искомого пропускания. Против шкалы пропускания (равномерная от 0 до 100%) нанесена шкала оптических плотностей Д (логарифмическая) в соответствии с формулой

Д =  lg T (3)

Величина Д меняется в пределах от 0 (Т = 1) до  (Т = 0), однако фактическая возможность измерения Д определяется ценой деления шкалы. Так, при Т =0,1 Д = 1; при Т = 0,01 Д = 2; производить измерения с точностью, превы-

шающей 1% по Т, нереально, причем при малых пропусканиях (Т  10%) ошибка резко возрастает. Поэтому реальным диапазоном измерения Д является 0  Д  2. По этой причине фактическая возможность абсолютного измерения концентрации исследуемого вещества по оптической плотности, в соответствии с формулой Ламберта-Бера

Д = сL (4)

где с – концентрация,  - коэффициент молярной экстинкции, L – толщина образца (длина оптического пути излучения в испытуемой среде), затруднена. Однако относительная концентрация выживших частиц в зависимости от времени облучения t и дозы облучения D, имеющей смысл суммарной падающей на исследуемый пул клеток энергии излучения, может быть найдена на основе предложенной в МГУ им. М.В. Ломоносова [3] и развитой в МГТУ им. Н.Э. Баумана математической модели (см. приложение 1). Простейший вариант этой модели основан на предположениях о пренебрежении репаративными процессами, преобладании химического механизма тушения, отсутствии кислородного голодания и определении доли выживших клеток сразу после прекращения облучения. Результатом расчета при таких предположениях будет следующая зависимость относительной концентрации от дозы:

(5)

Здесь обозначено  t = D – доза воздействующего излучения, - постоянная, характеризующая скорость гибели сенсибилизированных клеток в начальный момент облучения. Найденная зависимость (5), будучи построенной в координатах ( ), и называется дозовой кривой. Коэффициент характеризует крутизну этой кривой (см. приложение 1). В виде дозовой кривой можно представить и экспериментальные данные. Пример дозовой кривой приведён на рис. 9. Поскольку в дозовую кривую (5), определяющую зависимость ln от дозы облучения, входит не абсолютная концентрация сенсибилизированных частиц, а относительная, приводить в соответствие измеряемую оптическую плотность Д с абсолютной молярной концентрацией с нет необходимости, тем более, что коэффициент молярной экстинкции  априори неизвестен.

Рис.9. Расчётные дозовые кривые в предположении о преобладании химического механизма тушения.