Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, трьох підрозділів з викладеними результатами власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних літературних джерел у кількості 300 (39 праць авторів з України та країн СНД та 261 робота іноземних авторів). Роботу викладено на 157 сторінках, вона містить 17 таблиць і 20 рисунків, які займають 25 повних сторінок.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи дослідження. Досліди виконано на 84 кролях обох статей віком 6-8 місяців, масою 1800-2300 г. Тварин утримували в стандартних умовах віварію. З метою відтворення первинних розладів енергетичного обміну і ранніх дистрофічних змін судинної стінки тваринам вводили монойодацетат (МЙА) – класичний інгібітор гліколітичних і окисних процесів (Lundsgaard E., 1930; Нейфах С.А. з співавт., 1962; Уебб Л., 1966; Лаборі А., 1970). У дослідженнях Ю.В.Биця (1973, 1999) було доведено, що двотижнева МЙА-інтоксикація закономірно супроводжується істотними змінами енергетичного обміну судинної стінки, які виявляють себе падінням інтенсивності гліколізу і пентозного циклу, розладами клітинного дихання, зменшенням вмісту макроергічних сполук (АТФ, креатинфосфату). Зазначені зміни спричиняють розвиток дистрофічно-склеротичних уражень артеріальної стінки з ознаками, характерними для артеріосклерозу Менкеберга.

У наших дослідженнях введення кролям МЙА здійснювали щодоби внутрішньовенно (у крайову вену вуха) з розрахунку 10 мг/кг протягом 3, 7 і 14 діб. Відповідну кількість речовини розчиняли в ізотонічному розчині NaCl (10 мг на 1 мл), pH доводили до 7,4 насиченим розчином NaHCO₃ або 0,1 н розчином NaOH.

Для визначення ролі ПОЛ у патогенезі уражень судинної стінки, зумовлених МЙА, нами застосовано засоби ангіопротекторної дії з різними механізмами впливу на кровоносні судини: а) жиророзчинний антиоксидант – вітамін E (токоферолу ацетат); б) блокатор кальцієвих каналів - ніфедипін; в) антикальциногенний препарат – етан-1-гідрокси-1,1-дифосфонову кислоту (ЕГДК).

У роботі здійснювали щоденне протягом 14 діб поєднане введення тваринам:

1) МЙА (10 мг/кг, внутрішньовенно) та вітаміну E (10% олійний розчин токоферолу ацетату з розрахунку 50 мг/кг у шлунок через зонд за 2 години до введення МЙА);

2) МЙА і ніфедипіну (30 мг/кг у шлунок через зонд за 30 хвилин до введення МЙА);

3) МЙА та ЕГДК (130 мг/кг у шлунок через зонд за 2 години до введення МЙА).

Через 24 години після останнього введення препаратів тварин забивали, відтворюючи повітряну емболію.

Для оцінки ПОЛ у стінках артерій і вен було обрано дві групи показників: 1) ті, що характеризують інтенсивність реакцій вільнорадикального окиснення, - вміст гідропероксидів ліпідів (проміжних продуктів ПОЛ) і основ Шиффа (кінцевих продуктів); 2) ті, що відображають стан антиоксидантних систем судинної стінки, - глютатіонпероксидазна, супероксиддисмутазна і каталазна активності тканин артерій і вен. Для кількісної оцінки дистрофічних змін, що виникають у судинах за умов МЙА-інтоксикації нами використано методики визначення об’єму інулінового простору та вмісту води і кальцію у тканинах судин.

Вміст загальних ліпідів у тканинах кровоносних судин визначали за методом Folch J. та співавт. (1957) у модифікації Bligh E.G. і Dyer W.J. (1975). Визначення вмісту гідропероксидів ліпідів проводили спектрофотометрично за характерним для дієнових кон’югатів УФ-спектром поглинання розчину ліпідів у метанол-гексані (5:1) за довжини хвилі 232-234 нм (Bolland J.L., Koch J.P., 1945). Вміст основ Шиффа визначали спектрофлюорометрично (максимум збудження флюоресценції – 360 нм, максимум випромінення – 420-440 нм) (Csallany A.S., Ayal K.L., 1976).

Визначення супероксиддисмутазної (СОД) активності проводили спектрофотометрично (довжина хвилі 540 нм) за відсотком інгібування відновлення нітротетразолію синього (Fried R., 1975). Каталазну (КТ) активність визначали спектрофотометрично (довжина хвилі 410 нм) за здатністю цього ферменту гальмувати утворення з солями молібдену стійкого забарвленого комплексу (Королюк М.А. та співавт., 1988). Визначення глютатіонпероксидазної (ГП) активності проводили за методом Pinto B.E. і Bartley W. (1969) у модифікації Кругликової Г.А. і Штутман Ц.М. (1976). Як субстрат окиснення використовували пероксид водню. Активність ГП оцінювали за різницею між кількістю відновленого глютатіону в досліджуваній та контрольній (без H₂O₂) пробах (Sedlak J., Lindsay R.H., 1968). Розрахунок ферментної активності проводили на одиницю маси загального білка, вміст якого в тканинах визначали за методом Lowry O.H. (1973).

Вміст води визначали, фіксуючи зміну ваги зразка тканини при його повному висушуванні до постійної ваги в сушильній шафі при температурі 105°C. Визначення об’єму інулінового простору проводили дифеніламіновим методом (Браун А.Д., 1937; Виноградова Н.А., 1967). Вміст загального кальцію визначали спектрофотометрично в атомно-абсорбційному режимі при довжині хвилі 422,2 нм.

Матеріал статистично опрацьовано з використанням параметричних (Урбах В.Ю., 1985) і непараметричних (критерій Вілкоксона-Манна-Уїтні, точний метод Фішера) критеріїв статистики (Гублер В.Е., Генкін А.А., 1973).

Результати дослідження та їхній аналіз. 1. Інтенсивність ПОЛ та антиоксидантна ферментна активність стінок артерій і вен у динаміці монойодацетатної інтоксикації.

Серед універсальних механізмів ушкодження клітин чільне місце посідає ПОЛ – реакції вільнорадикального окиснення ненасичених жирових кислот, що входять до складу фосфоліпідів клітинних мембран. Про інтенсивність цього процесу може свідчити вміст проміжних (гідропероксиди ліпідів – ГПЛ) і кінцевих (шиффові основи – ШО) продуктів ПОЛ у тканинах кровоносних судин.

У виконаних нами дослідженнях простежено динаміку змін цих показників у стінках артерій і вен за умов розвитку МЙА-інтоксикації. Показано, що вже через 3 доби від початку експерименту у всіх вивчених судинах реєструється істотне зростання рівня ГПЛ. Так, вміст цих сполук збільшувався у грудній аорті на 13,2%, черевній аорті – на 17,8%, у легеневій артерії – на 35,1%, у задній порожнистій вені – на 59,4%. Рівень ШО у цих судинах також зростав, але, на відміну від показника ГПЛ, розбіжності з контролем були статистично не достовірними (p > 0,05).

Через 7 діб МЙА-інтоксикації збільшення вмісту ГПЛ становило (якщо порівнювати з контролем) у грудній аорті 41,3%, черевній аорті – 57,5%, легеневій артерії – 130,6%, задній порожнистій вені – 194,2%. Водночас статистичної достовірності набули і зміни вмісту ШО у всіх вивчених судинах. Так, зростання цього показника склало в грудній аорті 35,6%, черевній аорті – 42,4%, легеневій артерії – 109,9%, задній порожнистій вені – 138,8%.

Нарешті, двотижневий строк експерименту характеризувався максимальним зростанням вивчених показників як в артеріальних, так і венозних судинах. Вміст ГПЛ збільшувався в грудній аорті у 2,2 рази, черевній аорті - у 2,5 рази, легеневій артерії – майже в 4 рази, задній порожнистій вені – у 6 разів проти контрольних величин. Зростання показника ШО становило в грудній аорті 2,2 рази, черевній аорті - 2,4 рази, легеневій артерії – 3.4 рази, задній порожнистій вені – приблизно 5 разів.

Таким чином, введення тваринам МЙА з самого початку супроводжується активацією ПОЛ, про що свідчить накопичення його проміжних і кінцевих продуктів у стінках артеріальних і венозних судин. При цьому статистично достовірні зміни вмісту ГПЛ починають виявлятися дещо раніше (через 3 доби), якщо порівнювати з показником ШО (через 7 діб).

За рівнем зростання цих показників вивчені судини можна розділити на три групи: 1) грудна і черевна аорти (найменший ступінь збільшення); 2) легенева артерія (середній ступінь); 3) задня порожниста вена (максимальне збільшення). Це може свідчити про те, що за умов отруєння монойодацетатом інтенсифікація ПОЛ у венозних судинах відбувається у значно більшій мірі, ніж в артеріальних.

Вивчення антиоксидантної ферментної активності показало, що вже через 3 доби від початку введення тваринам МЙА з’являються ознаки антиоксидантної недостатності, зокрема реєструється статистично достовірне зменшення ГП-активності стінок артеріальних і венозних судин. Так, падіння активності цього ферменту становило в грудній аорті 20,2%, черевній аорті – 20,1%, легеневій артерії – 25,9%, задній порожнистій вені – 26,9%. Що стосується двох інших антиоксидантних ферментів – СОД і КТ, то зміни їхньої активності у ці строки експерименту не виходили за рамки випадкових відхилень (p > 0,05).

Через 7 діб МЙА-інтоксикації відзначали дальше падіння активності ГП в стінках вивчених артерій і вен: у грудній аорті воно складало 44,1%, у черевній аорті – 47,6%, у легеневій артерії – 47,5%, у задній порожнистій вені – 53,7% (при порівнянні з контролем). Крім того, у ці строки експерименту достовірно зменшувалася й активність ще одного антиоксидантного ферменту – СОД - у всіх вивчених судинах: у грудній аорті – на 25,9%, черевній аорті – на 33,9%, легеневій артерії – на 33,4%, задній порожнистій вені – на 31,9%. Найстійкішою до дії отрути виявилася КТ. Тільки в одній судині – задній порожнистій вені – її активність істотно зменшувалася (на 33,3%), а в стінках артерій відхилення показника від норми були статистично не достовірними.

Для двотижневого строку експерименту було характерним значне падіння активності всіх вивчених антиоксидантних ферментів у всіх кровоносних судинах. Так, активність ГП зменшувалася в грудній і черевній аорті, а також в легеневій артерії майже в 4 рази, а в задній порожнистій вені – приблизно в 5 разів. Падіння активності СОД становило в грудній і черевній аорті майже 2 рази, легеневій артерії – 2,4 рази, задній порожнистій вені – приблизно 6 разів. І, нарешті, активність КТ зменшувалася в грудній і черевній аорті майже на 40%, у легеневій артерії – більш ніж у 2 рази, у задній порожнистій вені – у 3 рази.

Таким чином, результати проведених досліджень показали, що введення тваринам МЙА веде до зменшення активності усіх вивчених антиоксидантних ферментів. Проте, тут виявляє себе певна закономірність, яка полягає в тому, що “найчутливішим” до МЙА- інтоксикації ферментом є ГП, активність якої падає вже через 3 доби від початку експерименту. Через 7 діб починає зменшуватися СОД (у всіх судинах) і КТ (тільки у венах) активність, а через 14 діб – активність КТ в усіх вивчених артеріях.

2. Вплив ангіопротекторів з різними механізмами дії на інтенсивність ПОЛ та антиоксидантну ферментну активність у стінках кровоносних судин за умов монойодацетатної інтоксикації.

Порушення діяльності антиоксидантних систем і активація процесів ПОЛ, виявлені нами в артеріях і венах під час розвитку МЙА-інтоксикації, можуть бути важливим патогенетичним механізмом дистрофічно-склеротичних уражень судинної стінки. Для визначення ролі цих чинників у розвитку ушкодження судин нами застосовано фармакологічні препарати з різними механізмами дії: вітамін Е, ніфедипін, ЕГДК. Насамперед стояло завдання визначити вплив цих агентів на інтенсивність ПОЛ і антиоксидантну ферментну активність тканин артерій і вен у тварин з МЙА-інтоксикацією.

Дані, наведені в табл. 1 і 2, свідчать про те, що вітамін Е істотно зменшує вміст ГПЛ і ШО у стінках артерій і вен у тварин, яким вводили МЙА. Так, падіння вмісту ГПЛ у грудній і черевній аорті становило 23-24%, у легеневій артерії – 31,7%, у задній порожнистій вені – 22%. Слід, однак, зазначити, що повна нормалізація показників ПОЛ не наставала – вони й надалі залишалися далекими від рівня, характерного для судин інтактних тварин. Що стосується двох інших ангіопротекторів – ніфедипіну і ЕГДК, то вони істотно не впливали на вміст ГПЛ і ШО в артеріальних і венозних стінках тварин з МЙА-інтоксикацією (p > 0,05).

Таблиця 1. Вміст гідропероксидів ліпідів у стінках кровоносних судин кролів за умов поєднаного введення тваринам монойодацетату та одного з ангіопротекторів (вітаміну Е, ніфедипіну, ЕГДК) протягом 14 діб (нмоль /мг ліпідів; M±m, n=6)

Примітка: * - p < 0,05 – статистично достовірні розбіжності відносно контролю; ▲- p < 0,05 – відносно інтактних тварин