Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.1 (Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - 2001), страница 14

Ригш8 1уяя, Ьас1епа1 рго1ешя, Ьго(сеп сеП ччаПя, апс) с(епагигес( сЬгопюяогпа1 РХА Ъесогпе епшеяЬес( лп 1аг8е согпр!ехея 1Ьат аге соагес( яч(ТЬ с(от(есу1 яиЬаге. ТЬеяе сошр1ехея аге еЕЕ!с(епг1у ргес(рйагес1 Ггош яо1шюп шЬеп яоеПши юпя аге гер!асес( Ъу рогаяяшш юпя (!5ЬНогоячкг апс1 Впг1се !98!). Айег 1Ье 11епашгес1 шагепа1 Ьая Ьееп гегпочес1 Ьу сепгг(6л8агюп, паПче р1аяпЫ РЫА сап Ье гесочегет( !гоги ЕЬе яирегпагап1. АПса!ше!уяя (и 1Ье ргеяепсе ог 505 Ь а Яех(Ые сесЬпнрле йаг ячог115 тчеП яч)й аП я!та!пя 01 Е. соИ апс1 шПЬ Ьасгепа1 ол1гигея гап8(п8 (и 5(ге (гош 1 ш1 го >500 ш1. ТЬе с1ояес1 с(гси1аг р1аяиЫ РХА гесочегес( (гош ЕЬе!уяаге сап Ъе рип()ет! ш шапу сПйегепт ячауя апс( го ййегепс ехсепгя, ассогсПп8 го йе пеесЬ от йе ехрегипепг (р1еаяе яее ТаЫе 1-4).

ТАВЕЕ 1-4 5таП-, Мег(!ишп авг( Еаг е-яса!е Рте агаВовя о( Р!аятЫ 0(5(А Ркотосос 1 Ркотосо12 М151!РкеРАЙАТ!Ох!5 (1-2 мг) М!О!РкеРАВАТ!Озяя (10 мг) Ркотосог 3 МАх1РкеРАВАтяоня (500 м1) ТЬе гаге-1ившв8 яер ш й|з ргогосо! Ь со!шпи сЬгов!агокгарЬу, тчЬ!сЬ !!пигз 1Ье вшвЬег о( ргерага6овз йаг сав Ье ргосеззет( япш11авеоы!у. У!еЫз о( Ь(ВЬ-сору-вишЬег р!аявЫя гапке 1гош 20 го 50 р8 о( Рля(А. А(гег рипйса6ов Ьу со!шпв сЬгошагокгарЬу, 1Ье р!азшЫ 0ЫА шау Ье изет( го ггавз(есг си!тагес( шавипа!(ав се1!з.

Маву пивтргерага6овз сав Ье ргосеззет) ягви!гавеоиз!у. Хге!дз чагу Ьепчеев !00 вк авт( 5 )тк о( ОЫА, с!еревгПвВ ов 1Ье сору вшвЬег и( 1Ье р!аявЫ. О!ЛА Ь а зш1аЫе зиЬзггаге (ог гезггкгюв еигушез, Ьиг 1Ье у!е!1Ь аге Вевега1!у гоо !отч Гог 1гавз(есгюв оТ шапипа!!ав се11з. Ригйег рип6сагюв гз гецшгет( Гог 0ЫА зесрлевсш8 (р1еазе зее йе !в(опваг!ов раве! ов РЕяй!Е!САТ!ОН ОГ РЕА5М!О 0(ч(А ВЧ РЕС РКЕС!Р!ТАТ!ОЬ().

ТЫз шейой Ь з!ояч авт( чету ехревяче !( СзС!-егЬЫгшв ЬгошЫе е9ш!(Ьт(иш т(евягу ВгагПевп аге изет( (ог рипйса6ов (РгогосоЬ !О авт( ! 1). А!гегваВче рштйсаиов ргосес)игез !вс!ис)е РЕСт ргесярЬа6ов (Ргогосо! 8) аво со!швв сЬговга1окгарЬу (Ргогосо! 9).

У!е!Вз о( ЬтВЬ-сору-вшвЬег р!аявЫя гапке (гош ! го 3 гщ рег 1агке-зса!е си11ше. Аз 1Ье е(Ес!евсу о( Вгошшк, рип(у(в8, авг( ава!уг!в8 р!аявЫ 0ЫА Ьая !шргочет), 1Ье веет! (ог !агке-яса!е ргерагагювя Ьаз Вгеаг!у ЕПпишзЬей МахтргерагаПовз аге вою а!гвозт ав ех1шс1 зрестез. Ргогосо! 1: РгерагагЕоп оу Р1аятЫ Е9ЬЕА Ъу А Пса!гпе Еуя1я яч1гЬ БРБг МЕп1ргерагагЕоп 1.33 То епяиге йа! йе си1гиге!я адес1иаге1у аегагед: ° ТЬе чо!шпе оЕ йе си1гиге гиЬе яЬои!д Ье аг 1еаяг Еоиг !!шея Ягеагег йап гЬе чо1шпе оЕ йе Ьасгепа! си1гиге. ° ТЬе гиЬе йои1д Ье 1оояе1у сарред.

° ТЬе си!гиге яЬои1д Ъе 1псиЬасед мчгЬ ч15огогь а51гагюп. 2. Роиг 1.5 гп1 оЕ !Ье си1!иге Еп1о а гп1сгоуиде гиЪе. СепгпЕиПе аг шахппшп яреед Еог 30 яес- опдя ас 4'С 1п а ш1сгоуице. 51оге йе шшяед рогЯоп оЕ 1Ье опП1па! си11ше а! 4'С. 3. ччЬеп соп1пуиПа11оп Ея сошр1е!е, гегпоче йе гпесПшп Ъу аярггаЯоп, 1еач1пц ЕЬе Ъасгепа! ре11ес ая с1гу ая рояяЕЬ1е. ТЬЬ егер сап Ье соичешепг1у ассогпр1ЬЬед яч1й а д1ярояаЫе РЕрепе др ог Раягеиг р1реие аггасЬед го а часишп Ппе апд а яЫе апи ЯаяП 1р!саяе яее Р15иге 1-7П Ыяе а Пепс1е часишп апд соисЬ гЬе Яр со йе яшЕасе оЕ йе !и1шд. Кеер ЕЬе г1р ая Еаг аячау Егот гЬе Ьасгепа! реПег ая рояя1Ые ая йе Яшс1 Ь чдйдгаип 6 огп йе гиЬе.

Т!Яя пишгпгаея йе г1яП йас йе реПег чдП Ье яис1сед шсо йе яЫе апп Яая1с. А1гегпадче1у, гегаоче йе мрегпагапг ия1пц а ргреггог ог Раяеш РЕрепе апд Ьи1Ъ. Тгяе йе ргреие Яр го часиит йе ячаПя оЕ гЬе гиЬе го геточе апу адЬегеп! с!гор!егя оЕ Яшд. ТЬе репа1гу Еог ЕагПпЯ го геточе аП ггасея оЕ пяейшп Егогп гЬе Ьасгепа! РеПег Ь а ргерагагюп оЕ р!аяиЫ 1!ХА йас и геяясапс со с1еачаце Ьу геягпсгюп епгутея. ТЬь Ь Ьесаияе сеП-ячаП согпропепь ш йе гпейши шЬгЬ1г йе асгюп оЕ гпапу геяггкгюп епгутея. ТЬ1я ргоЕЯегп сап Ье ачоЫед Ьу геяырепсПпП гЬе Ьасгепа! реПег Еи 1се-со1д 5ТЕ 10.25х чо1шпе оЕ гЬе ос!5!па! Ьассепа! си!гиге! апс1 сепгг1Еи51пЯ аЯа1п. !.У515 ог СеИ5 4.

Кеяиярепд йе Ъас1епа1 реПеС 1и 100 р! оЕ ке-со1д АПса!1пе 1уяя яо1ибоп 1 Ъу ЫПогогь чоПеядпя. Ма!се яиге йаг гЬе Ьассепа! реПег Ь сагир!есе!у сПярегяед 1и АПсаПпе 1уяя яо!одоп 1. Чогсех1пЯ гио т1сгоЕице гиЪея ыпш!гапеоия1у чдй гЬе1г Ьаяея гоисйиП 1псгеаяея гЬе гаге аид еЕЯс1еису чдгЬ ячЬдсЬ ЕЬе Ъасгепа! реПеь аге геыярепдес1. ТЬе ог151па1 ргояосо! 1ВггпЬоггп апс1 19о!у 19791 саПед Еог ГЬе гье оЕ 1уюгугпе ас йгя рогиг Го аяьг ш йяю!шюп оЕ гЬе Ьасгепа! сеП ячаПя. ТЬгя яер сап Ье яаьду оппггед ячЬеп деаПпЯ яч1ЕЬ Ъассепа! сиЬигея оЕ !еы йап 10 т! ш чо1шпе.

иьроваы реПе! !!пе часиие !гара Е!С11КЕ 1-7 Ая 1га11оп оЕ 5ирегпа1ап1я НоЫ йе ореп гп1сгоЕиПегиЬе а! ап аиП!е, чЫЕЬ ЕЬе реПег ои !Ье иррег яде. 11яе а д1ярояаЫе р1рессе Яр аггасЬес1 Ео а насиигп Ппе Ео яч1йдгаяч Е!шд !гоги !Ье ЕиЬе. 1пяег! 1Ье Яр1ияг ЬепеаЕЬ ЕЬе гпепьсия оп ЕЬе !оччег яде оЕ 1Ье ЕиЬе. Моче !Ье Яр 1оччагд йе Ьаяе оЕ йе !иЬе ая ЕЬе Яшд 1я чЫйдгаччи. Ояе Пеиде яисЯоп 1о ачо!д дгаъипц йе реПе1 1п1о 1Ье р1реие Яр. Кеер ЕЬе епд о! 1Ье Пр аччау Егогп йе реПе1. Е1паПу, часиигп 1Ье ячаПя оЕ ЕЬе 1иЬе го гепюче апу адЬегепг с!горя оЕ ЯиЫ. 1.34 С!таргет 1: Р!авт!т)в ап|Е ТЬет Еуве)и!певв и ЕъЕо!еси!ат С!опту А|Ы 200 )л! оЕ ЕгевЫу ртерагет! АП|аПпе 1уяв во!и6оп П Ео еасЬ Ъастепа1 виврепв!оп. С1ове тЬе тиЪе щЬт)у, апт) ппх йе сопсептв Ьу !инетт!пц тЬе тиЪе гарЫ1у Пче !пиеа.

Ро пот чоттех! йоге тЬе тиЬе оп ке. Ма1|е вше тЬат йе спите витЕасе оЕ йе тиЪе со|пев ш соптаст ъч!й АП|аПпе !уяв во!ииоп !!. А|Ы 150 )т! оЕ !се-соЫ АП|а!ше 1уяв во!и6оп 111. С1ове йе тиЪе ап|1 еПврегве АП|аПпе 1уяв во! итюп 111 ЕЬтоииЬ йе ч!всоив Ьастепа1 1увате Ъу шчегПпц ЕЬе тиЬе вечега1 типев. 5тоте йе тиЪе оп ке Еог 3-5 пппитев. Септг!6луе ЕЬе Ьастепа! 1увате ат шахппшп вреет! Еог 5 пппитев ас 4'С ш а ппсто6лце. ТгапвЕег тЬе вирегпатапт то а ЕгевЬ тиЬе.

(ОртЕопа1) АсЫ ап ет!иа! чо!шпе оЕ рЬепоЬсЫого)опп. Мит ЕЬе отцаи!с апт) ат)иеоив рЬавев Ъу чоттех!иК ап|1 йеп септпуиде йе епш!яоп ат шахппши вреет! Еог 2 пппитев ас 4'С ш а ш!стоблце. Тгапвуег ЕЬе ат!иеоив иррег!ауег то а ЕгевЬ шЪе. 5оп|е !пчевт!аатотв ПпП йе ехкасиоп ъчПЬ рЬепо1:сЫоготопп то Ье иппесеяату, Ноъчечет, |Ье е!шипаиоп оЕ й|в втер воше|ипев гели!|в !и Е|ЬтА йа| !в геявтапт |о с!еачаае Ьу гевттк|юп епгушев. ТЬе ритрове оЕ ехттаст!па ъч||Ь сЫогоЕопп Ь то гетпоче гевЫиа! рЬепо! Етош |Ье атлиеоив рЬаве.

РЬепо1 !в вПаЬ|!у во!иЫе ш Н О, Ьш Ь сап Ье |Е!вр!асет! |ото |Ье огаап!с рЬаве Ьу сЫогоЕопо. Уеатв аао, !т ч|ав сопипоп ргаст!се !п во|пе !аЬотатопев то |Ее!ест гев!т!иа! рЬепо! ш ЕУЬЕА ртератаПопв Ьу япеП. ТЬ|в ртасисе !в по !опает тесошшепт!ей !сесолтету о1 Р!аьгпЫ Р!Ь)А Ргес!рКате пис1ек аснЬ Егош тЬе вирегпатапт Ьу аеЫ!пК 2 чо!шпев оЕ ейапо! ат гоош теш- регатиге. М)х йе во1и6оп Ьу чоттех!иК апт) йеп аПоъч йе пихшге то яап|1 Еог 2 тпиштев ат гоош тешрегаШге. СоПест йе ртес!р!тате|! пис!ек асЫа Ьу септпйцатюп ат гпахппшп врее|1 !ог 5 пшплтев ат 4"С !и а ппстоЕиПе.

!т и Ьевт |о еет иио |Ье ЬаЪ|т оЕ а!ъчаув аггапа!па йе ш!стойкие тиЬев |и йе ваше ъчау ш йе тп!сто6|ае гогот, !.е., |и отт)ет, ъчЬЬ йе|г р!авис Ь!паев а!ъчаув ро!пттпе оитъчатй ТЬе ртес|р!тате ъч!П соПест оп йе !пыт)е вигЕасе Еиг|Ьевт Его|и йе септет оЕ тотаиоп. Кпоъч!па ъчЬеге то !оо!т ша!тев Ь еаыег то Етп|Е ч|яЪ!е ртес!рЬатев апт) то т!Ьво!че "!пч!в!Ые" ртес|р|татев еЕЕ|с!епт!у. ЕаЬеПпа Ьой |Ье вЫев ап|! тор| оЕ тиЪев рточЫев с!еаг Ыепийсатюп оЕ еасЬ шЬе, ечеп !Е йе ш1| вши|!ест. 10. А|Ы 1 п|1 оЕ 70% ейапо! то йе реПет ап|1 !пчегт тЬе с1овес1 тиЬе вечега1 Пп|ев. Кесочег йе Р!ъ)А Ъу сепЕп6лцат!оп ат п|ахппшп врее|1 Еог 2 пипшев ат 4'С |п а писгойце. 12.

Ара!п гетпоче аП оЕ ЕЬе вирегпатапт Ьу лепт!е аврйа6оп ав т!евст!Ъет! |п 5тер 3. Та!|е саге ъч!ЕЬ |Ьтв яер, ав |Ье реПет вотоеИ|пев |Еоев пот а|!Ьете ППЬОу то |Ье тиЬе. 13. Кешоче апу Ъеат)в оЕ ейапо1 тЬат Еопп оп йе в!т!ев оЕ тЬе тиЬе. 5тоте йе ореп шЬе ат тоотп тетпрегатиге ип6! йе етЬапо! Ьав ечарогате|! ап|1 по Пшй ы н)яЫе тп тЬе тиЪе (5 — 10 пппитев). !Е йе реПет оЕ Ы'ЛА Ь тлг!ет! |и а т!ев!ссатог ог ипт!ег часишп, и Ьесошев сПтуки!| то йяо1че ипт)ет вопле сЬсшпвтапсев апт! и|ау |Еепатите Е5чагеп ет а!. !987). Елту!па |Ье реПет Еот то — ! 5 пипи|ев ат гоотп тетпрегашге !в ивиаПу вийк!епт Еот |Ье е|Ьапо! |о ечаротате ъч!ЕЬоит йе Ел!|А Ьесопипа т!еЬутлгатет!. 14. Р!вво!не йе пис1ек аснЬ ти 50 Ет! оЕ ТЕ (рН 8 О) сиота!п)пц 20 )тд/ш1 Р)ъ)аве-6ее К)ъ)аве А (рапсгеа6с Клаве).

ътоттех йе во1и6оп лепт!у Еот а Еечч весопт!в. 5тоте йе Р)ъЕА во1итюп ат — 20'С. рог тесошшепт!ат!опв оп тгоиЫевЬоот!па, р!еаве вее ТаЫе 1-5 ш Ртотосо! 5. Кепюне тЬе вирегпатапт Ъу цепЕ1е авр!га6оп ав т)евст!Ъет! ш Ятер 3 аЬоче. 5тапт! йе илЪе ш ап тпчегтес1 роя6оп оп а рарег тоъче1 то аПоъч аП оЕ тЬе Пи!П то |1га|п аъчау. !)ве а К!шъч!ре ог еПвроваЫе р!репе Пр со геп|оче апу |1горв оЕ Пшс1 ат)Ьет!пд то ЕЬе ъчаПв оЕ ЕЬе тиЬе. Рго1осо! 2 Ргерагабоп о1 Р!аспид 0МА оу АПса! ~пе Еуыь ЫЙ 505: М~йргерага6оп р САУМ!Р Е)МА МАу ВК !ЮСАТЕР ЕКОМ СМТЕКМЕРСАТК-ВСАСВ (20 — 50 сп1) ЬаеСеба1 еп11игеа Ъу СгеаСгпепс сс«1«Ь а11«а!с ап«1 Ю5. ТЬе геаи11(па РМА ргерага6оп !а аи/саЬ!е Еог апа1уяа Ъу е1ессгорЬогеяа ог геаспс6оп еп«/оппс1еаае «11аеьсюп. АЕсег ЕигсЬег рипйса6оп Ьу со1шпп сЬогспасоагарЬу, йе ргерагасюпа шау Ье иае«! со сгапаЕесс спалила!Еап се11я МАТЕИАйб СА()Т!ОМ: Р1еаае аее Аррепс/!х с 2 Сог арргорпа(е Ьап«Е!!па о( гпа(епа!а гпаг/сес/ иай <! >.

ВоЕЕегв апеЕ йо16Есопь Р/еаае аее Аррепс!!х ! Еог со«пропел!а оЕ атос/с ао/иС!опа, Ьи//ега, апс! «еааеп(я Р!1и(е а(осЬ хо!01!опт Со ЕЬе арргорпасе сопсепсга6опя А//«айле /уа/ь сю/ийоп / рог ргерагасюпс оЕ р!а«пн«( РМА йас аге со Ье еаЬ)ессеи со Ецгйег рп«!Е«гас(оп Ъу «Ь«оюасоцгарЬу (р!гасе «ее р«осего! 9), «се«!!е АИ«а!(пе !ус!ь ю!ш!оп ! псау Ье сарр!еюеп«Ы !ыс ЪеЕоге ые сг!«Ь сЬе арргорпасе го!оюе оЕ 20 шц!ю! РМасе-Егее р«Масе А (рап«геасге р«Масе) со В!че а 6па! сопсепсгавоп оЕ (00 /«В/гп!.

Аагпсюп оЕ р«Маке ь пос ге«о«пшел«(е«С ас «Ь!с яаВе !Е йе РМА !с со Ье свгйег рп«!Е«е«Е Ъу оСЬег гпе«Ьо«са (р!еасе сее р«о«ого!с !0 ап«С (Ц. А//«айпе /уа/а ао/ийоп В во!ос!оп !! «Ьоп16 Ъе Еге«Ыу р«ера«е«( ап«Е шев ас гоогп сеюрегасше. А!/«айпе /уа!а ко/ийол /й Апс!Ь/ос!с Еог р/аьгпп/ ье/есйоп Есйапо! !сор«орало/ Рйело/«ой/о«оуо«т (!:!, е/с«) (!) 5ТЕ Орс!опа!, р!еасе «ее 5«ер 3. ТЕ (рН 8.0) соп/а!и!пВ 20 щ(т! КА/аае А Мейа ЕВ, УТ ог Те«660 Вгогй СепЕТЕЕщев апеЕ КРЕогь 50«уа!! 55-34 гоСо«о«ег/ива/елг 1.35 !.Зб СЬаргег 1: Р!аггпиЬ апс! ТЬегг ЮеЕи!пея гп Мо1есп!аг С!оп!по МЕТНО0 РгерагаПоп оЕ СеПВ 1. 1поси!аСе 10 ш! оЕ псЬ гпегПшп (!.В, с'Т, ог ТегпПс Вгой) сопСашшВ СЬе арргорпаСе апПЬ1- оск ълсЬ а япВ1е со!опу оЕ сгапаЕоппег) Ьассепа. 1псиЪасе йе си1сиге онеги)ВЬс ас 37'С ъч)сЬ лВогоиа аЬа)с)пВ. То епаиге сЬас сЬе си!сиге Ь агСеоиасе!у аегасей ° ТЬе чо!ише оЕ йе си!сиге сиЬе хЬои!П Ье ас !еаас Еоиг сппеь егеасег йап сЬе чо!шпе оЕ сЬе Ьасгепа1 си!сше.

° ТЬе сиЬе аЬои!д Ье !похе!у саррей ° ТЬе си!шге аЬои!В Ье спсиЬасегС ипсЬ ч!Вогоиа арсаиоп. 2. ТгапьЕег СЬе си!Сиге шСо а !5-гп! СиЪе апс1 гесонег йе ЬасСепа Ьу сепгпЕиВагюп аС 2000!! (4000 гргп сп а 5огнаП 55-34 госог) Еог !О шшисез ас 4'С. 3. Кегпоче йе псееПшп Ъу Вепг!е аьрггаПоп,!еаншВ СЬе ЪасСепа1 реПеС аа с)гу ав роаяЫе. ТЬЬ хсер сап Ье сопчешепс!у ассогпрПхЬег! и!сЬ а г!ЬроааЫе р!Репе Ор ог Раасеиг р!Репе апасЬес1 со а часишп Ппе апгС а ягСе апп Пах!с (р!еаае аее Р!Ваге 1-7). Ссре а Вепс!е часишп апгС соисЬ сЬе Пр со йе аиггасе оЕ сЬе Пии!й Кеер йе бр ах Еаг ачгау Егош сЬе Ьассепа! РеПес аа роя яЪ!е аа сЬе Ли!П ы ьчсЬПгасчп сгогп йе шЪе. ТЫышп!шсхех сЬе г!а)с йас сЬе реПес чпП Ье аисссег) !псо йе а!гсе апп Пах!с. А1сегпас!че!у, гепюче сЬе ягрегпасапс ияпВ а р!Репог ог Раасеиг р!Рессе апгС Ъи!Ь. ~.Ъе йе р!Репе с!р со часишп сЬе счаПа оЕ йе ыЪе со гегпоче апу аг)Ьегепс Игор!еса оЕ Пшй ТЬе репа!су Еог Еа!ПпВ со гегпоче аП !гасах оЕ гпегПшп Егогп йе Ьассепа! РеПес ь а ргерагабоп оЕ р!аяпЫ !75!А сЬас ь геа!хсапс со с!еачаВе Ъу гессе!сс!оп епхугпея ТЫх !а Ьесаые сеП-счаП согпропепсх ш йе псейшп шЫЬсс сЬе ассюп оЕ гпапу геяпсбоп епхугпея ТЬЬ ргоЫегп сап Ье ачоЖе6 Ьу геяырепйпВ йе Ьассепа! РеПес !и !се-со!д 5ТЕ !0.25х чо!игое о! йе опабпа! Ъассепа1 си1сиге) апс! сепсг!Еих!пВ аВа!и.