1625912814-86e4cf3c2f3a4758cc82c296d453744e (800503), страница 5
Текст из файла (страница 5)
РМР реагирует со второй специфичнойкетокислотой в обратном направлении с образованием исходногошиффова основания PLP с NH2-группой Lys апофермента иаминокислоты:R1–CH–COO- + PLP → R1–C–COO- + PMPNH2OPMP + R2–C–COO- → R2–CH–COO- + PLPONH2Таким образом, белок в роли фермента или апоферментаучаствует в следующих главных процессах:• Белок обеспечивает специфическое узнавание субстрата ипоследующее образование продуктивного фермент-субстратногокомплекса.• Кислые и основные аминокислотные остатки ферментаучаствуют в общем кислотно-основном катализе.• В ряде случаев фермент ковалентно связывает субстрат собразованием промежуточного продукта и выступает какнуклеофильный катализатор.• В качестве апофермента белок обеспечивает ковалентноесвязывание в активном центре кофактора, простетической группы илиобратимое связывание кофермента, а также определяет их функцию.342.2.
Кинетика ферментативных реакцийДля описания кинетики, представленной на графике иописывающей действие многих ферментов, в 1913 г. Л. Михаэлис иМ. Ментен предложили простую модель, в основе которой лежитнеобходимый промежуточный этап катализа − образованиефермент-субстратного комплекса (ES) (1).Кроме того, существует еще ряд ограничительных условий (онибудут указаны по порядку в скобках), при выполнении которыхмодель и выведенное ниже уравнение Михаэлиса–Ментенправильно описывают кинетику реакции.Предложенная модель может быть выражена следующейпоследовательностью реакций фермента (Е) с субстратом (S), приэтом, с каждым активным центром Е связывается только однамолекула S (2):k1k2E+SES → E + P.(I)k-1Постулируется, что продукт реакции, Р, не превращается висходный субстрат S (3).Равновесие устанавливается очень быстро, и вторая стадияреакции необратима (лимитирующая стадия) (4), скоростьферментативной реакции выражается какV = k2[ES].35(II)В квазистационарных условиях (5) концентрацияпромежуточных продуктов остается постоянной, т.
е. d[ES] / dt = 0:k1[E][S] = (k-1 + k2)[ES] .(III)Преобразуем это уравнение:[E][S][ES] =.(k-1 + k2)/k1(IV)Вводим новую константу КМ − константу Михаэлиса:КМ = (k-1 + k2)/k1,(V)тогда уравнение (IV):[E][S][ES] =.КМ(VI)Концентрация субстрата не меняется в ходе реакции, т. е.концентрация свободного субстрата равна его начальнойконцентрации при условии, что [E] << [S] (6), тогда какконцентрация несвязанного Е:[E] = [Е]о – [ES],где [Е]о – общая концентрация фермента.(VII)Подставим это выражение в уравнение (VI) и решимотносительно [ES]:[ES] = [Е]о[S][S] + КМПодставим выражение (VIII) в уравнение (II):36.(VIII)V[S]= k2 [Е]о[S] + КМ.(IX)Максимальная скорость реакции Vmax достигается принасыщении активных центров фермента субстратом, т. е.
когда[S] >> КМ, при этом [S] / [S] + [КМ] ≈ 1. Следовательно,Vmax = k2[E]o.(X)Подставив это выражение в уравнение (IX), получим уравнениеМихаэлиса–Ментен:V = Vmax[S](XI)[S] + КМилиV=Vmax1 + КМ/[S].(XII)Эти уравнения соответствуют кинетической зависимости,представленной на графике выше. При низких концентрациях S,когда S << КМ, V = Vmax / КМ [S], т. е.
скорость прямопропорциональна концентрации S. При высоких концентрациях S,когда S >> КМ, V = Vmax, т. е. скорость максимальна и не зависит отконцентрации S.Если [S] = КМ, то V = Vmax / 2. Таким образом, физический смыслвеличины КМ заключается в том, что она равна концентрации S,при которой скорость реакции составляет половину максимальной.Величины КМ и Vmax варьируют в широком диапазоне дляразличных ферментов (табл. 4, 5).Для большинства ферментов величина КМ лежит в пределах-110 − 10-6 М. Значение КМ зависит от природы S, от условийреакции: ионной силы, температуры, рН.37Таблица 4Величины КМ для различных ферментовФерментХимотрипсинКарбоангидразаАргинин-тРНКсинтетазаСубстратАцетил L-триптофанамидСО2КМ, М5⋅10-38⋅10-3ArgтРНКАТР3⋅10-64⋅10-73⋅10-4КМ связана с константами скоростей отдельных стадий катализаКМ = (k-1 + k2)/k1 (V).
В случае, когда диссоциация комплекса ESна E и S протекает быстрее, чем образование Е и Р, имеет местосоотношение: k2 << k-1 иКМ =k-1[E][S]=,k1[ES],т. е. КМ = KES. Таким образом, второе смысловое значение КМ: КМравна константе диссоциации ES-комплекса, если k2 намногоменьше, чем k-1 (7-е ограничение).В данном случае КМ является мерой прочности ES-комплекса,мерой сродства (аффинности) субстрата к Е: чем меньше величинаКМ, тем выше сродство.Максимальная скорость Vmax отражает число оборотов фермента,если известна концентрация активных центров [Е]0, так какVmax = k2[Е]0. Кинетическая константа k2 называется числомоборотов.Таблица 5Величины k2 для различных ферментовФерментКарбоангидразаАцетилхолинэстеразаХимотрипсинДНК-полимераза IЧисло оборотов/cек600 00025 00010001538Число оборотов фермента − это то количество молекулсубстрата, которое превращается в продукт реакции в единицувремени при полном насыщении фермента субстратом.
Другимисловами, это мера эффективности работы фермента. Самымактивным из известных ферментов является карбоангидраза(табл. 5).Методы определения величин КМ и Vmax. Кинетическиеконстанты односубстратной реакции определяют путем измеренияскорости реакции при различных концентрациях субстрата (S).Наиболее удобный способ для их расчета − это линеаризацияуравнения Михаэлиса–Ментен, графические методы определенияконстанты КМ и Vmax.
Ниже представлены графики ЛайнуивераБерка и Иди-Хофсти.Ниже представлен график Лайнуивера–Берка.1/V-1 / KMαtg α = KM/VmaxKM . 111=+Vmax Vmax [S]V1 / Vmax11/[S]/ [S]Статистический анализ показал, что метод Иди–Хофсти даетболее точные результаты, чем метод Лайнуивера–Берка, так как впервом случае и зависимые, и независимые переменные входят ввеличины, откладываемые на обеих осях координат. Очень точныйграфический метод − «прямой график» Эйзенталя−КорнишБоудена. Координаты экспериментальных точек откладывают наосях, затем через каждую пару точек проводят прямую.Полученные прямые пересекаются в точке {KM;Vmax}.39Далее приведен график Иди–Хофсти.VmaxV = Vmax - KM .
V[S]Vαtg α = KMVmax / KMV/[S]Ниже представлен график Эйзенталя–Корниш-Боудена.VVmaxV4V3V2V1–[S]4 –[S]3 –[S]2 –[S]1KM[S]Ингибирование и активация ферментов. Эффекторы −соединения, специфично влияющие на скорость ферментативныхреакций. Одни из них ускоряют процесс и называютсяактиваторами, другие замедляют и носят название ингибиторовферментов.
По принципу действия ингибиторы делят на обратимыеи необратимые.40Обратимоеингибирование.Конкурентныйингибиторструктурно подобен субстрату и потому связывается в активномцентре фермента, вследствие чего препятствует связываниюсубстрата в том же центре (см. ниже рисунок). Конкурентныйингибитор уменьшает скорость реакции, снижая долю молекулфермента, связавших субстрат. Неконкурентный ингибитор исубстрат могут связываться молекулой фермента одновременно,т. е. участки их связывания не перекрываются. Неконкурентныйингибитор уменьшает число оборотов фермента, а не снижает долюсвязавших субстрат молекул фермента.Конкурентное и неконкурентное ингибирование различаются покинетике.Далее приведена схема конкурентного ингибирования.+SEESE+ PV = Vmax+I[S][S] + KM 1 +[I]KiKi =[E] [I][EI]EIОтличительной особенностью конкурентного ингибированияявляется способность субстрата при достаточно высокойконцентрации (~ 5–10 Км) предотвращать ингибирование, другимисловами, защищать фермент.41Ниже представлены графики:Лайнуивера–Берка+ Конкурентный ингибитор1/VБез ингибитора[I]KM .
1111+=+KiVmax Vmax [S]V1 /1/[S][S]Иди–ХофстиVБез ингибитора+ КонкурентныйингибиторV /V/[S][S]V = VmaxKM .V[I][S] 1 + KiДалее приведена схема неконкурентного ингибирования.E+SES+I+I+ S ESIEIE+ PV=VmaxK[I]1+ M 1+ K[S]i42Ki =[E][I][EI]Видно, что при неконкурентном ингибировании Vmaxуменьшается, а КМ не изменяется, и повышение концентрации S неснимает ингибирования.Лайнуивера–Берка+ Неконкурентный ингибитор1/VБез ингибитора1/[S]1=V1+[I]KiVmax[I]KiKMVmax[S]1++Иди–ХофстиVБез ингибитора+ НеконкурентныйингибиторV =Vmax[I]1+ KiV/[S]VKM .[S]432.3. Классы ферментативных реакций.
Основные коферментыФерменты классифицируются как катализаторы определенныхреакций, а не как индивидуальные химические соединения.Согласно классификации Международного союза по биохимии(IUB), все ферменты разделены на шесть классов, каждый класс –на подклассы и последние, в свою очередь, на подподклассы.Каждый фермент, кроме того, имеет свой порядковый номер внутриподподкласса.Иначеговоря,ферментхарактеризуетсяклассификационным номером, состоящим из букв КФ (ЕС, EnzymeClassification) и четырех чисел: номера класса, подкласса,подподкласса и порядкового номера.
Существует систематическаяноменклатура(IUB)ферментовиихтривиальные,общеупотребительные, названия.Первый класс − оксидоредуктазы, ферменты, катализирующиеокислительно-восстановительные реакции.Рациональная (систематическая) номенклатура включаетназвание восстановителя (донора электронов), окислителя(акцептора электронов) и названия класса.Так, фермент, катализирующий окисление этанола доацетальдегида (1-й подкласс):СН3СН2ОН + NAD+СН3СНО + NAD⋅Н + Н+,называется алкоголь:NAD+ оксидоредуктаза (ЕС 1.1.1.1.). Крометого, ферменты, использующие в качестве окислителя кофермент −никотинамидадениндинуклеотид (NAD+) (1-й подподкласс),называют дегидрогеназами, и поэтому этот фермент обычноназывают алкоголь дегидрогеназой.Исключительно важный подподкласс оксидоредуктаз (ЕС 1.2.4.),катализирующих окислительное декарбоксилированиеα-кетокислот с участием кофактора липоамида и коферментатиаминпирофосфата, будет рассмотрен позже в гл 3, разд.
3.1.(пируват-дегидрогеназный комплекс).44Строениеникотинамидадениндинуклеотида(фосфат)а;NAD(P) − переносчика протонов и электронов.HHCOOPO+ONOHOHOPOOOONPOONH2NCO+2H-2HOONH2OOHNONPOO+HOHONOOHOH (NAD(P)+PO+NH2NNNH2NNOO)OHOOH (NAD(P)H + H+NAD(Р)+ + 2Н+ +2е-PO)ONAD(Р)Н + Н+Второй класс − трансферазы, ферменты, катализирующиенегидролитические реакции переноса радикала от молекулы-донорак молекуле-акцептору:XY +ZX + YZ (X, Z ≠ H2O или OH-).Систематическое название − XY:Z Y-трансфераза.Два сложных органических соединения − тетрагидрофолат(THF, производное фолиевой кислоты) и S-аденозилметионин,являются важными коферментами трансфераз 1-го подкласса,переносящими одноуглеродные остатки.Тетрагидрофолат; ТHF:45H2NN1381C2N34CHN86C5NHC7THFCH2CH910HCCHCHOHCOOHCCCH2 NHОстаток птеридинаHCCNH CH CH2 CH2 COОстатки глутаминовой кислоты(n = 3 или 7)Остатокп-аминобензоила555NNHN10N5-метилTHFCH2N10+CHN10N5,N10-метенилTHFN5,N10-метиленTHF55NHNCHHN10NHN5-формиминоTHFHCN10ON10-формилTHFОбразование метионина:SHSCH2CH2CH2HC+OHONCH3nN5-CH3-THFCH3+CH2+NH3HCCCOOгомоцистеинO46THF+NH3Oметионин (Met)Образование S-аденозилметионина:NH2SCH3NOCH2+CH2HCCOOOP+OONH3POOOPOOHCH2COHCOH2ONCH3+SHCCH2CH2HCHCCH2HCCONO+NH3 OHCHCCNCCHCHOHON+CHOHNCHOHNH2CNCHHCMetNCCHOOOPOPOOOHOPOOOS-аденозилметионинТретий класс − гидролазы, ферменты, катализирующие реакциигидролиза.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
