109637 (708466), страница 4

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

7.1.1.3.Субстраты

Для выделения, отбора, хранения и культивирования микромицетов использовали следующие субстраты (табл.2.):

таблица 2

7.1.1.4.Пробы

В работе были использованы образцы древесины телеграфных столбов, подвергшихся воздействию микроорганизмов (Новгородский регион), любезно предоставленныe Марьяновской Юлией Валентиновной (кафедра МБТ СПбГТИ(ТУ)).

7.1.2.Методы

7.1.2.1.Выделение культур микромицетов

Выделение первичных культур велось на модифицированной среде Ван-Итерсона. Для устранения посторонних микроорганизмов образец короткое время обжигали в пламени спиртовки и помещали на питательную среду. Микроорганизмы, находящиеся на поверхности, гибли, а те микробы, которые находились внутри образца сохраняли жизнеспособность. Продолжительность инкубации составляла 60 суток. Остальные условия оговариваются особо.

Выделение чистых культур велось на агаре Чапека с использованием стандартных микробиологических методов /43/.

7.1.2.2.Изучение морфологических и физиолого-биохимических свойств культур микромицетов

Для изучения морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств культур микромицетов использовали стандартные микробиологические среды и методы /41/.

Цитоморфологические наблюдения проводили с помощью общепринятых методов и растворов красителей /41/.

7.1.2.3.Отбор штаммов-деструкторов ПАУ

Отбор целлюлолитических штаммов мицеллиальных грибов оcуществляли на среде Чапека c целлюлозой и ПАУ (содержание ПАУ 5% от массы целлюлозного субстрата). Оценка роста производилась визуально.

7.1.2.4.Твердофазное культивирование микроорганизмов

Культивирование мицелиальных грибов в твердой фазе проводили в кюветах емкостью 0,5 л и бутылях емкостью 30 л.

Содержание среды в кюветах-250 г, в бутылях-2,5 кг. Перемешивание осуществляли вручную: в кюветах-шпателем, в бутылях встряхиванием. Периодичность перемешивания и остальные условия оговариваются особо.

Культивирование мицеллиальных грибов проводилось на специально разработанных средах, представляющих собой измельченную древесину, инпрегнированную ароматическими веществами и увлажненную раствором солей и сахаров. Объем увлажняющей жидкости составлял 200-400 мл на 1 кг древесины.

Посевной материал для кювет выращивали на чашках Петри на тех же средах. Чашки Петри засевали суспензией спор, полученной путем смыва увлажняющей жидкостью с газона 7-суточной культуры на агаре Чапека. Для засева бутылей использовали содержимое кювет, во всех случаях посевной материал вносился в количестве 10% от объема ферментационной среды.

7.1.2.5.Фотолитическая обработка субстратов

Субстраты помещали в кюветы, которые располагались под источником излучения на расстоянии 50-60 см. Чтобы избежать перегрева поверхности субстрата, лампа работала периодически, не более 4 часов в течении рабочего дня.

В качестве источника излучения использовали газоразрядную лампу ПРК-7 (l_max=257,3 нм).

7.1.2.6.Определение ПАУ в твердой фазе

Экспериментальные образцы подвергались сушке в термостате при 105^ОС до постоянного веса.

Экстракцию ПАУ осуществляли в аппарате Сокслета в течении 6 часов. В качестве экстрагента использовали предварительно очищенный от примесей углеводородов гексан.

Полученный экстракт упаривали до небольшого (4-5мл) объема. Затем в него добавляли около 1г активированного силикагеля (Silpearl) и упаривали досуха. Далее пробу вносили в разделительную колонку с силикагелем и вымывали посторонние примеси 40мл гексана. Затем элюировали фракцию ПАУ 120мл смеси гексан:хлористый метилен (4:1). Фракцию, содержащую ПАУ упаривали до объема 0,25-1,0мл.

Газхроматографический анализ сконцентрированных компонентов проводили на хроматографе ’’Цвет-570М’’ с пламенно-ионизационным детектором на кварцевой капиллярной колонке (30м, 0,25мм) с неподвижной фазой DB-5 при программном повышении температуры от 70 до 320^ОС со скоростью 4^ОС в минуту. Количественные данные получали методом абсолютной градуировки детектора стандартными растворами ПАУ (’’Экрос’’, Санкт-Петербург). Градуировку по бенз[а]пирену осуществляли при помощи ГСО 7064-93.

Идентификацию компонентов смеси осуществляли хромато-масс-спектрометрически на приборе LKB-2091 фирмы LKB-BROMMA (Швеция). Хроматографические условия были те же, что и в случае количественного анализа. Идентификацию проводили путем сравнения масс-спектров электронного удара при помощи компьютерной информационно-логической системы ’’Компас-МС’’.

7.2.Результаты и обсуждение

7.2.1.Направленный поиск микромицетов-деструкторов ПАУ

Микробная деструкция экотоксикантов в последние десятилетия стала объектом интенсивных исследований практически во всех развитых странах мира. Эффективность этого процесса определяется в первую очередь активностью штамма-деструктора экотоксикантов. Необходимость интенсифицировать процессы биоремедиации побуждает исследователей как к проведению селекции коллекционных штаммов, так и к поиску новых деструкторов /44-46/.

Проведенные эколого-таксономические исследования показали, что представители микрофлоры лесной подстилки (рода Alternaria, Cladosporium, Helmintosporium-подобные, Chaetomium и др.), а так же почвенной микрофлоры ( рода Aspergillus, Trichoderma, Penicillium и др.) способны разлагать лигниноцеллюлозу и разрушать ароматические ядра лигнина /34/.

Фитопатогенные грибы так же способны разрушать природные аромитические вещества (Fusarium) /34/.

Обычно для выделения штаммов, разлагающих то или иное вещество, используют жидкие или агаризованные среды, содержащие это вещество как единственный источник углерода и энергии. Однако, по нашему мнению, для биоремедиации следует использовать микроорганизмы, сочетающие в геноме способность утилизировать как экотоксикант, так и целлюлозу, которая содержится в почве и является основным компонентом твердых отходов. Мы решили, что наилучшей средой для отбора микромицетов, разрушающих ПАУ в соокислительных условиях будет среда Чапека с целлюлозой и ПАУ. В качестве критерия отбора использовали общепринятый метод оценки роста культур мицеллиальных грибов по характеристике их роста в баллах через определенные, одинаковые для всех штаммов периоды времени. Такая методика позволяет отобрать наиболее резистентные и быстрорастущие штаммы.

Для выделения ПАУ-резистентных целлюлолитиков из природных биоценозов на наш взгляд наиболее подходит среда модифицированная Ван-Итерсона /42/, где полоска фильтровальной бумаги была инпрегнированна ПАУ. На такой среде селективно отбираются ПАУ-резистентные микроорганизмы. Для отработки методики и с целью поиска штаммов-деструкторов ПАУ нами из техногенных биоценозов был выделены ряд микроорганизмов.

Из биоценоза свалки старых телеграфных столбов было отобрано 5 проб древесины, имеющей ярко выраженные биоповреждения. Пробы помещали в стерильные пробирки с ватно-марлевыми пробками высушивали и хранили при обычных условиях.

Выделение первичной культуры велось на модифицированной среде Ван-Итерсона. Для устранения посторонних микроорганизмов образец короткое время обжигали в пламени спиртовки и помещали на питательную среду. Микроорганизмы, находящиеся на поверхности, гибли, а те микробы, которые находились внутри образца сохраняли жизнеспособность. Продолжительность инкубации составляла 60 суток, температура поддерживалась на уровне +25^ОС.

Идентификация велась на сусло-агаре и среде Чапека. Было выделено и идентифицировано 5 штаммов: Trichoderma linorum, Trichoderma sp. и три представителя рода Fusarium. Хранили штаммы на модифицированной среде Ван-Итерсона. Во избежании путаницы штаммам были присвоены музейные номера (см. табл.3. ).

таблица 3

*Н- Новгородский рег., 1- порядковый № штамма

Для проведения исследований мы использовали культуры, выделенные из техногенных биоценозов, а так же коллекционные, любезно предоставленные Оследкиным Ю.С. (разд. ). Отбор штаммов оcуществляли на среде Чапека с целлюлозой и ПАУ (содержание ПАУ 5% от массы целлюлозного субстрата). Оценка роста производилась визуально. Результаты представлены в таблице 4.

таблица 4

Практически все исследуемые микроорганизмы обладали способностью расти и образовывать колонии на поверхности субстрата. Однако у большинства культур процент заселения поверхности субстрата был незначителен (до 10%). По-видимому таким культурам требуется более длительный срок адаптации или наличие стимуляторов роста. Наибольшей скоростью роста и высокой степенью колонизации (до 60% площади субстрата) обладал штамм Trichoderma lignorum №37. Характер роста данного микроорганизма соответствовал каталожному описанию и заключался на начальных этапах в образовании небольших колоний диаметром 1-1,5 мм, постепенно сливающихся в единое целое и формирующих поверхностный мицелий светло зеленого цвета. Этот штамм и был отобран для дальнейших исследований.

Характеристики

Список файлов реферата