66622 (687662), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Методические указания предназначены для центров государственного санитарно-эпидемиологического надзора, других организаций, осуществляющих контроль за качеством продуктов питания и других объектов внешней среды.
2. Сущность метода
Методические указания содержат описание ускоренного метода качественного и количественного обнаружения санитарно-показательных микроорганизмов в пищевых продуктах и других объектах исследования, основанного на регистрации относительного электрического сопротивления питательной среды, происходящего под влиянием процессов роста и жизнеспособности микроорганизмов.
Одной из основных задач, стоящих перед учреждениями Госсанэпидслужбы России в соответствии с Законом РСФСР "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения", является внедрение современных инструментальных методов оценки опасных и потенциально опасных для человека химических, физических и биологических факторов окружающей природной, производственной и социальной среды как в рамках функции Госсанэпиднадзора, так и в системе обязательной сертификации продукции и услуг по показателям ее безопасности для здоровья человека. Классические методы микробиологических исследований, используемые в практической деятельности бактериологических лабораторий учреждений службы, достаточно длительны, трудоемки и позволяют получать результаты через несколько суток, что значительно снижает оперативность и эффективность госсанэпиднадзора, особенно при проведении исследований скоропортящейся продукции.
Существующие в настоящее время микробиологические автоматизированные системы на основе импедансных технологий позволяют получать быстрые (в течение нескольких часов) и надежные результаты для большого числа одновременно исследуемых образцов. В основе метода импедансной микробиологии лежит измерение изменения электрической проводимости питательной среды под воздействием роста микроорганизмов, что впервые было показано Стюартом в 1898 году. Однако этот метод получил свое развитие лишь в 70-е годы с появлением соответствующего электронного оборудования и компьютерной техники. Импедансная микробиология является непрямым культуральным методом обнаружения микроорганизмов путем определения электрического импеданса. Изменение импеданса происходит в питательной среде по мере того, как ее химический состав изменяется в результате роста и метаболической активности микроорганизмов. При этом незаряженные или слабозаряженные составляющие питательной среды превращаются в сильнозаряженные конечные продукты: белки метаболизируются до аминокислот, углеводы и жиры до органических кислот. Эти электрохимические изменения приводят к существенным изменениям импеданса, экспоненциальные изменения сигнала могут наблюдаться, когда количество микробных клеток достигает порога 106 - 107 клеток/мл. Время, необходимое для достижения значимого изменения импеданса, называется временем определения импеданса (IDT), значение которого обратно пропорционально начальной концентрации микроорганизмов в пробе.
Среди разработанных и применяющихся в настоящее время исследовательских микробиологических систем, предназначенных для ускоренного обнаружения микроорганизмов на основе импедансных технологий, наибольшее распространение получил микробиологический анализатор "Бак Трак 4100" производства австрийской фирмы "SY- LAB". "Бак Трак 4100" является автоматизированной системой для ускоренной (в течение 6 - 8 часов) количественной и качественной оценки степени микробного загрязнения продуктов питания, питьевой воды, напитков, парфюмерно-косметической продукции, контроля за стерильностью различных материалов и растворов.
Прибор автоматически определяет основные санитарно-значимые показатели - мезофильные аэробы и факультативные анаэробы, бактерии группы кишечных палочек (колиформы), патогенные микроорганизмы (в том числе сальмонеллы и листерии), сульфитредуцирующие клостридии, лактобациллы, энтерококки, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, а также дрожжи и плесени. Кроме того, прибор позволяет также определять наличие ингибиторных веществ в различных продуктах и пищевом сырье. Главным преимуществом микробиологического анализатора "Бак Трак 4100" по сравнению с аналогичными приборами других фирм (благодаря наличию двух пар электродов в измерительных ячейках) является одновременная регистрация двух параметров: М-параметр - относительное изменение полного электрического импеданса (сопротивление + емкость) питательной среды и Е-параметр - относительное изменение импеданса в зоне двойного электрического слоя между электродами. Оба электрических параметра показывают высокую степень корреляции с кривой роста, однако сдвиги в концентрации ионов, происходящие в процессе жизнедеятельности микроорганизмов, сильнее влияют на Е-параметр, чем на М-параметр, который описывает весь объем образца. В системе "Бак Трак 4100" для обнаружения микроорганизмов, вызывающих незначительные изменения проводимости питательной среды (дрожжи и плесени), используется метод "непрямого импеданса". Сущность метода заключается в регистрации СО , образующегося в 2 процессе метаболизма микроорганизмов, в присутствии щелочи:
СО = 2ОН -> СО + Н О.
Наиболее существенным преимуществом метода "непрямого импеданса" является его большая чувствительность. Так, методом "непрямого импеданса" возможно определять 10 - 10 клеток дрожжей в мл, что на порядок ниже по сравнению с прямым. Таким образом, измерительная система прибора "Бак Трак 4100" реализует принцип разделения импедансного сигнала, регистрируя одновременно как импеданс среды, так и электродный импеданс, а также позволяет проводить измерения прямым и "непрямым методом", что делает возможным использование любых (в том числе и отечественных) питательных сред для проведения исследований.
3. Методики определения санитарно-показательных, потенциально патогенных и патогенных микроорганизмов
3.1. Определение мезофильных аэробных и факультативных анаэробных микроорганизмов
1. Среда BiMedia 001A (готовится в соответствии с инструкцией - см. гл. 10).
2. Протокол измерения.
2.1. Дать среде BiMedia 001А уравновеситься при комнатной температуре в течение 6 ч.
2.2. Установить температуру 30 -С на приборе "Bac Trac".
2.3. В основном меню программы "Bac Trac" установить следующие параметры:
Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):
Время исследования (Duration) 24 ч
Масштаб измерений (Scale):
М-параметр 0 - 50%
Е-параметр 0 - 50%
Время задержки (Delay) 1 ч.
Пороговые значения (Thresholds): выбирается соответствующий калибровочный файл для данного вида продукции и параметры пороговых значений вносятся автоматически.
Учет результатов проводится по М-параметру.
3. Добавить в каждую измерительную ячейку по 9 мл среды BiMedia 001A.
4. Внести 1 мл предварительно подготовленного в соответствии с требованиями нормативной документации исследуемого образца продукта в измерительную ячейку с 9 мл среды.
5. Тщательно перемешать содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивать ячейку!).
6. Для контроля среды используйте одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 001А (без инокулята).
7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начать измерения.
8. После того как каждая позиция блока будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор "Вас Trac".
Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически. При пересечении порогового значения происходит автоматический подсчет численности микроорганизмов в исследуемом образце.
УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ:
Результат определения КОЕ (CFU) выдается автоматически в виде количества микроорганизмов в 1 мл исследуемого продукта. Если исследуется твердый продукт, то результат определения КОЕ (CFU) необходимо умножить на степень разведения (х 10) для получения КОЕ в 1 г продукта. Примечание. Основные этапы создания калибровочного файла рассмотрены в гл. 4 данных Указаний.
3.2. Определение бактерий группы кишечных палочек - БГКП (колиформ)
1. Среда BiMedia 160B (готовится в соответствии с инструкцией - см. гл. 10).
2. Протокол измерения.
2.1. Установить температуру 37 -С на приборе "Bac Trac".
2.2. В основном меню программы "Bac Trac" установить следующие параметры:
Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):
Время исследования (Duration) 24 ч
Масштаб измерений (Scale):
М-параметр 0 - 50%
Е-параметр 0 - 50%
Время задержки (Delay) 1 ч
Пороговые значения (Thresholds):
М-параметр 5%
Е-параметр 10%
Проводить учет результатов по М-параметру.
Пороговое значение по времени
(Time limit 1) 12 ч
Пороговое значение по времени
(Time limit 2) 18 ч.
3. Добавить в каждую измерительную ячейку по 9 мл среды BiMedia 160B.
4. Добавить исследуемый образец из соответствующего разведения продукта, в котором не допускается наличие БГКП.
4.1. Если наличие БГКП не допускается в 0,01 г продукта, то для исследования берется 1 мл из разведения 1:100.
4.2. Если наличие БГКП не допускается в 0,1 г продукта, то для исследования берется 1 мл из разведения 1:10.
4.3. Если наличие БГКП не допускается в 1 г продукта, то для исследования берется 5 мл из разведения 1:5 и добавляется к 5 мл среды 160В двойной концентрации.
Возможен также альтернативный вариант при использовании измерительных ячеек на 100 мл.
4.4. Если наличие БГКП не допускается в 1 г продукта, то для исследования берется 10 мл из разведения 1:10 и добавляется к 90 мл среды BiMedia 160B.
4.5. Если наличие БГКП не допускается в 10 г продукта, то для исследования берется 10 мл из разведения 1:1 и добавляется по 5 мл гомогената в две измерительные ячейки к 5 мл среды 160В двойной концентрации.
Возможен также альтернативный вариант при использовании измерительных ячеек на 100 мл.
4.6. Если наличие БГКП не допускается в 10 г продукта, то для исследования берется 10 мл из разведения 1:5 и добавляется к 50 мл среды BiMedia 160B двойной концентрации.
5. Тщательно перемешать содержимое, вращая ячейку между ладонями (не переворачивать ячейку!).
6. Для контроля среды используйте одну измерительную ячейку с 10 мл среды BiMedia 160B (без инокулята).
7. Выбрать в основном меню программы ЗАПУСК ИЗМЕРЕНИЙ (Start Measurement) и начать измерения.
8. После того как каждая позиция в блоке будет отмаркирована как свободная на экране монитора, поместить измерительные ячейки в прибор "Bac Trac".
Измерение начнется автоматически через 1 ч после загрузки ячеек в прибор. Рост микроорганизмов и время определения изменения импеданса (IDT) будут записаны автоматически.
УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ:
Исследуемое количество продукта содержит единичные клетки БГКП, и проба считается контаминированной колиформами, если изменение импеданса превышает 5%-ное пороговое значение по М-параметру и 10%- ное пороговое значение по Е-параметру в течение 12 ч. При положительном результате наблюдается изменение цвета питательной среды (исходный пурпурный цвет среды меняется на желтый). Дополнение. Если клетки БГКП находились в стрессовом состоянии (термическая обработка, замораживание, высушивание и т.п.), то может наблюдаться более медленный рост культуры с увеличением времени определения по М-параметру до 18 ч. В этом случае проба считается контаминированной, если изменение импеданса превышает 5%-ное пороговое значение по М-параметру и 10%- ное пороговое значение по Е-параметру в течение 18 ч.
3.3. Определение сальмонелл
Определение сальмонелл возможно проводить либо на среде BiMedia 201B, либо на среде BiMedia 205A.
3.3.1. Определение сальмонелл на среде BiMedia 201B.
1. Среда: BiMedia 201B (Rappaport-Vassiliadis) (готовится в соответствии с инструкцией - см. гл. 10).
2. Предварительное обогащение.
Смешать необходимое количество продукта, в котором регламентируется отсутствие сальмонелл, со стерильной 1%-ной пептонной водой или средой Pre-Media 205А в соотношении 1:10.
Тщательно перемешать. Инкубировать в течение 14 - 16 ч при 37 -С.
Период предварительной инкубации для мясных, рыбных и молочных продуктов составляет 7 - 8 ч при 37 -С.
3. Протокол измерения.
3.1. Установить температуру 37 -С на приборе "Bac Trac".
3.2. В основном меню программы "Bac Trac" установить следующие параметры:
Параметры для инкубаторного блока (Adjust parameters):
Время исследования (Duration) 24 ч
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
