66615 (687657), страница 4

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

Для предотвращения роста на поверхности агара спорообразующих микробов и бактерий группы протея в Н-форме рекомендуется наслоить расплавленный и охлажденный голодный агар в количестве 1/3 объема первоначально внесенной в чашку среды. В результате образуется слой толщиной 3—4 мм.

После застывания агара чашки Петри перевертывают и помещают в термостат при 37 "С. Через 48 ч подсчитывают общее количество колоний бактерий, выросших на поверхности и в глубине агара, при помощи лупы с 5-кратным увеличением или специальным прибором. Для этого чашку кладут дном вверх на черный фон и каждую колонию отмечают тушью или чернилами для стекла, чтобы не сосчитать ее повторно.

При определении общего количества МАФАнМ в 1 г продукта подсчитанное количество колоний умножают на степень разведения анализируемого продукта по каждой чашке и выводят среднее арифметическое результатов подсчета двух чашек с разной массой продукта.

Бактерии группы кишечных палочек

Цель определения бактерий этой группы — проверка соблюдения режима варки колбас или санитарно-гигиенических условий в процессе производства сырокопченых колбасных изделий. Анализ на БГКП проводят по общепринятой методике с использованием сред, содержащих углеводы (глюкоза, лактоза). К ним относятся среды Хейфеца, ХБ, КОДА, Кесслер. БГКП ферментируют глюкозу и лактозу, поэтому в средах ХБ, Хейфеца и КОДА образуются кислые продукты, меняющие цвет индикаторов, а в среде Кесслер в поплавке образуется газ вследствие расщепления глюкозы.

При микробиологическом контроле колбасных изделий в производственных лабораториях можно ограничиваться обнаружением бактерий из группы кишечной палочки без их биохимической дифференциации. Для выявления БГКП в пробирки с 5 см³ среды ХБ или Хейфеца двойной концентрации либо КОДА вносят по 5 см³ испытуемой взвеси стерильной пипеткой с широким концом вместимостью 5—10см³. Допускается применение среды Кесслер по 10см³.

Посевы термостатируют при 37 °С в течение 18—20ч. Посевы смывов, отобранных тампонами с поверхности изделий без оболочки, выдерживают при температуре 43 °С (для обнаружения повторного бактериального загрязнения). При росте бактерий группы кишечной палочки среды ХБ и КОДА окрашиваются в желтый цвет, среда Хейфеца — в салатно-зеленый, на среде Кесслер в поплавке образуется газ.

Для окончательного заключения о присутствии в продукте БГКП проводят высев со среды Кесслер (забродившие пробы) или Хейфеца (изменение цвета среды) в чашки Петри со средой Эндо (Плоскирева, Левина) и помещают в термостат при 37 °С на 18— 20 ч. На среде Эндо бактерии этой группы образуют темно-красные колонии с металлическим блеском или розово-красные без блеска, на среде Плоскирева — кирпично-красные с глянцевой поверхностью, на среде Левина — темно-фиолетовые или фиолетово-черные блестящие колонии. Из подозреваемых колоний готовят мазки, окрашенные по Граму: при микроскопии обнаруживают грамотрицательные палочки различной величины.

Специфическое изменение сред ХБ и КОДА не требует дальнейшего подтверждения.

При заведомо высокой обсеменности анализируемого продукта его навеску массой не более 0,25 г помещают в пустую пробирку, закладывают комочек стерильной фильтровальной бумаги размером 5 х 5 см и стерильной стеклянной палочкой или фламбированной проволокой проталкивают его до дна (не уплотняя). В пробирку наливают среду ХБ, КОДА или Хейфеца (нормальной концентрации) на 3/4 высоты и помещают ее в термостат с температурой 37 °С на 8—10ч. При росте БГКП среды ХБ и КОДА изменяют цвет из фиолетово-пурпурного в желтый, среда Хейфеца — из красно-фиолетового до салатно-зеленого.

Определение БГКП в пробах, отобранных с поверхности изделий без оболочки тампонами, осуществляют аналогично.

Обнаружение грамотрицательных палочек, специфически изменяющих цвет жидких дифференциально-диагностических сред и образующих характерные колонии на элективных средах с лактозой, указывает на наличие БГКП.

Сальмонеллы

Навеску продукта массой 25 г от объединенной пробы, тщательно измельченной стерильными ножницами, вносят во флакон Сокслета, содержащий 100см³ среды обогащения (Мюллера, Кауфмана, хлористо-магниевой) или 225 см³ селенитового бульона. Содержимое перемешивают встряхиванием и помещают в термостат при 37 °С. Через 16—24 ч содержимое флакона тщательно перемешивают бактериологической петлей (диаметр 0,4—0,5 мм) или пастеровской пипеткой и проводят посев из среды обогащения в чашки Петри с предварительно подсушенной средой Эндо, БФА, Плоскирева, Левина или висмут-сульфит-агар (по выбору). При значительном помутнении следует использовать среду Плоскирева.

Посевы помещают в термостат при 37 °С на 16—24 ч. На среде Эндо бактерии из рода сальмонелл образуют бесцветные или с розовым оттенком колонии.

На среде БФА сальмонеллы растут в виде крупных, гладких, красноватого оттенка прозрачных колоний (колонии S. typhi suis как и на среде Эндо, мелкие). Колонии БГКП желто-зеленого цвета. Бактерии группы протея дают рост через 72 ч.

На среде Плоскирева колонии сальмонелл бесцветные, но более плотные и несколько меньшего размера, чем на среде Эндо; при обильном росте среда желтеет.

На среде Левина сальмонеллы растут в виде прозрачных, бледных, нежно-розовых или розовато-фиолетовых колоний.

На висмут-сульфитном агаре сальмонеллы образуют черные или коричневые колонии с металлическим блеском, участок среды под колонией чернеет. Исключение составляют некоторые серологические типы из группы С, растущие на этой среде в виде нежных светло-зеленых или крупных серовато-зеленых колоний.

Изолированные колонии (не менее 5), характерные для бактерий из рода сальмонелл, пересевают на трехсахарный агар Крумвиде—Олькеницкого в модификации Ковальчука штрихом по скошенной поверхности и уколом в столбик и инкубируют при 37 ± 1 °С в течение 12—16 ч.

При росте сальмонелл цвет скошенной поверхности среды Крумвиде — Олькеницкого в модификации Ковальчука розовый, столбик желто-бурый. Газообразование устанавливают по наличию трещин и разрыву столбика агара, образующие сероводород виды вызывают потемнение столбика.

Другие грамотрицательные бактерии семейства энтеробактерий дают следующие изменения цвета трехсахарного агара:

БГКП — равномерное окрашивание в синий или сине-зеленый цвет с образованием газа или без него;

бактерии из группы протея — окрашивание в ярко-красный цвет, в случаях выделения Н₂S может образоваться черный осадок;

шигеллы и возбудители брюшного тифа окрашивают скошенную поверхность в розовый цвет, столбик — в синий или сине-зеленый.

Вместо среды Крумвиде—Олькеницкого в модификации Ковальчука допускается посев: на углеводные среды короткого пестрого ряда с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом и мальтозой; полужидкий агар уколом (для определения подвижности); бульон Хоттингера для определения образования индола и сероводорода. При использовании полужидких сред с углеводами и индикатором ВР одновременно с ферментативной активностью можно определить подвижность бактерий.

Для дальнейшей идентификации бактерий готовят мазки, которые окрашивают по Граму, микроскопируют и изучают анти-генные свойства путем постановки пробной агглютинации на предметном стекле с агглютинирующей адсорбированной поливалентной сальмонеллезной О-сывороткой. При получении положительной реакции на стекле с поливалентной сывороткой проводят идентификацию с помощью монорецепторных агглютинирующих О-сывороток. Установив серологическую группу исследуемых бактерий, с помощью Н-сывороток определяют тип (вид) бактерий.

Обнаружение подвижных (кроме S. pullorum и S. gallinarum) грамотрицательных палочек, дающих характерный рост на элективных средах, неферментирующих лактозу и сахарозу, сбраживающих глюкозу и маннит до кислоты и газа (S. typhi suis не ферментирует маннит), образующих сероводород и не образующих индол, дающих положительную реакцию агглютинации с монорецепторными О- и Н-сальмонеллезными сыворотками, указывает на наличие бактерий из рода сальмонелл.

Протей

При необходимости проведения исследований на наличие в продукте протея в Н-форме 0,5 см³ анализируемой взвеси вносят в конденсационную воду свежескошенного мясопептонного агара, разлитого в широкие пробирки, не касаясь поверхности среды (метод Шукевича). Вертикально поставленные пробирки помещают в термостат при 37 °С. Через 18—24ч отмечают образование ползучего вуалеобразного налета с голубым оттенком. На скошенном мясопептонном агаре культура поднимается из конденсационной жидкости вверх по поверхности среды. При появлении характерного роста микробов рода протея микроскопируют окрашенные по Граму мазки и изучают подвижность микробов в раздавленной или висячей капле.

Для обнаружения нероящихся О-форм можно проводить посев на поверхность агара Плоскирева. О-формы протея растут на этой среде в виде прозрачных колоний, слегка подщелачивающих среду, окрашивая ее в желтый цвет. Затем колонии пересевают в среду Крумвиде—Олькеницкого в модификации Ковальчука, которая при наличии бактерий из группы протея окрашивается в ярко-красный цвет (вследствие расщепления мочевины). В результате выделения сероводорода может образовываться черный осадок с возможным разрывом агарового столбика.

Идентификацию протея проводят по морфологическим признакам (это грамотрицательные палочки), способности к гидролизу мочевины и образованию сероводорода. Дополнительно изучают ферментацию глюкозы (положительный результат), лактозы и маннита (отрицательный результат), подвижность в висячей или раздавленной капле либо проводят посев уколом в столбик полужидкой среды.

Обнаружение полиморфных грамотрицательных палочек, подвижных, образующих характерный ползучий рост на скошенном мясопептонном агаре (по Шукевичу), сбраживающих глюкозу и мочевину, неферментрующих лактозу и маннит, указывает на наличие в продукте бактерий из рода протея.

Стафилококки

Метод выявления стафилококков в продукте основан на определении морфологии, характера роста на питательных средах и способности отдельных стафилококков ферментировать лецитиназу и коагулировать цитратную плазму крови кролика под воздействием фермента коагулазы.

С этой целью из разведения анализируемой взвеси продукта в физиологическом растворе или пептонной воде (1 : 10) проводят посевы на МПБ, содержащий 6,5 % натрия хлорида. Через 24 ч

после инкубирования проводят пересев на молочно-солевой агар для выявления пигмента и желточно-солевой агар для выявления лецитиназной активности. Посевы термостатируют 24 ч при температуре 36 ± 1 °С и 24 ч выдерживают при комнатной температуре, затем учитывают результат. На поверхности питательной среды колонии стафилококка имеют вид слегка выпуклых блестящих круглых колоний с ровным краем. На молочно-солевом агаре лучше выявляется пигмент (эмалево-белый или золотистый), а на желточно-солевом агаре колонии стафилококков могут образовывать «радужный венчик», что является одним из признаков их патогенности (лецитиназная активность).

Не менее чем из 5 подозрительных колоний готовят препараты, которые окрашивают по Граму. При наличии стафилококков обнаруживают грамположительные кокки, располагающиеся неправильными гроздьями.

Одновременно для подтверждения патогенности выделенных стафилококков ставят реакцию плазмокоагуляции. В пробирку с 0,5 см³ цитратной плазмы крови кролика, разведенной физиологическим раствором в соотношении 1 : 4, вносят петлю чистой суточной культуры стафилококка и ставят в термостат при 37 °С. Ре-акцию плазмокоагуляции предварительно учитывают через 3— 4ч (не встряхивая пробирку). В сомнительных случаях оставляют в термостате для окончательного учета через 24 ч. Реакцию считают положительной, если плазма коагулирует в сгусток (на один — четыре плюса).

Для постановки реакции плазмокоагуляции используют, как правило, сухую нитратную плазму крови кролика.

При выявлении S. aureus в определенной навеске продукта поcевы считают положительными, если при подтверждении характерных колоний хотя бы в одной будет обнаружен золотистый стафилококк. При расчете на 1 г продукта количество подсчитанных колоний умножают на степень разведения и делят на объем посевного материала.

В соответствии с ГОСТ 1044.2 — 94 при определении количества S. aureus в 1 г (1 см³) продукта подсчет числа характерных колоний подлежит корректировке. Если в 80 % случаев (в 4 колониях из 5) подтвержден характерный рост, то считают, что все типичные колонии принадлежат к S. aureus.

Пересчет количества S. aureus на 1 г (1 см³) продукта проводят согласно ГОСТ 26670—91:

M=N/m*C

где N— степень разведения навески; т — количество инокулята, внесенного в чашку Петри, см³; С— округленное среднеарифметическое значение числа колоний.

Результат выражают числом от 1 до 9,9 • 10ⁿ.

Характеристики

Список файлов курсовой работы