Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

Имеются также данные о половых отличиях в активности КПН [101]. Половые гормоны влияют на активность КПН в отделах гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадной системы мышей: активность фермента у контрольных животных у самок выше, чем у самцов; экзогенно вводимые тестостерон и прогестерон по-разному снижают активность КПН в тканях животных разного пола [88].

Вовлечение КПН в формирование алкогольной зависимости [17, 32, 44, 45, 53, 54, 341], его участие в процессинге многих биологически активных пептидов [35, 48, 56, 131, 136, 151, 160, 172, 174, 200, 204, 292] обусловливают интерес к исследованию активности данного фермента и его участия в формировании толерантности к этанолу и предрасположенности к алкоголизму в постнатальном периоде у животных, испытавших пренатальное воздействие этанола.

1.3.3. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза

Первые упоминания о существовании фермента, отщепляющего аргинин и лизин с С-конца пептидов, но в то же время отличающегося от всех известных металлокарбоксипептидаз, относятся к 1993 году. Более подробные сведения появились в 1995 году [40, 41].

Фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза (ФМСФ-КП) – экзопептидаза, отщепляющая остатки основных аминокислот с С-конца пептидов. В частности, она отщепляет остаток аргинина от дансил-Phe-Leu-Arg [40], Cbz-Gly-Gly-Arg, Met⁵-энкефалина-Arg⁶ [47] с образованием, соответственно, дансил-Phe-Leu, Cbz-Gly-Gly, Met⁵-энкефалина. Дальнейшего расщепления образовавшихся продуктов не происходит. Фермент имеет Mr 100000 – 110000 и проявляет максимальную активность при pH 5,0-6,0 [40]. Фенилметилсульфонилфторид и п-хлоромеркурбензоат полностью ингибируют его. Иодоацетамид снижается карбоксипептидазную активность только на 40%. Другой реагент на SH-группы (N-этилмалеимид), хелатирующий агент ЭДТА и специфический ингибитор КПН ГЭМЯК, а также ионы Co²⁺ не оказывают влияния на активность фермента. ФМСФ-КП инактивируется при нейтральных и слабощелочных значениях pH, но стабилизируется NaCl [40]. K_m для синтетических субстратов дансил-Phe-Leu-Arg и дансил-Phe-Ala-Arg равна 48 и 96 мМ, соответственно.

ФМСФ-КП по своим физико-химическим свойствам схожа с лизосомальной карбоксипептидазой А (лизосомальная КПА, катепсин А, КФ 3. 4. 16. 1), но отличается от нее субстратной специфичностью и распределением активности в тканях и отделах мозга [127, 147, 195, 256, 257, 262, 289].

Тканевое и региональное распределение ФМСФ-КП имеет некоторые видовые отличия [38, 42, 43, 101, 102], но наибольшая активность у всех исследованных видов животных (ежа европейского, кошки, крысы, мыши) отмечена в надпочечниках и гипофизе [38, 42, 43, 88, 101, 102]. В отделах головного мозга активность ФМСФ-КП ниже, чем в периферических тканях и еще ниже, чем в гипофизе [38, 42, 43, 88]. Предполагается, что разных тканях ФМСФ-ингибируемая КП может быть представлена разными изоферментами. Поэтому выявленные отличия могут быть обусловлены разными соотношениями изоферментов у животных разных видов [43]. В мозге наибольшая активность фермента отмечается в отделах с преобладанием серого вещества (обонятельных луковицах, больших полушариях) или с высоким содержанием нейропептидов (гипоталамусе, стриатуме).

Обнаружены половые различия в активности ФМСФ-КП [41, 101, 102]. У самок активность фермента во многих тканях выше, чем у самцов [88]. Активность фермента изменяется в период полового созревания. Экзогенные тестостерон и прогестерон вызывают снижение активности ФМСФ-КП [88]. Наиболее существенное изменение активности ФМСФ-КП при введении тестостерона и прогестерона выявлено в гипофизе и половых железах у животных обоего пола. Минимальное влияние половых стероидных гормонов на активность ферментов обнаружено в гипоталамусе.

Имеющиеся данные позволяют сделать предположение о возможном участии ФМСФ-КП в процессинге, а по некоторым данным и в катаболизме [101], предшественников ряда нейропептидов [41, 43, 47, 101, 102].

Для уточнения биологической роли ФМСФ-КП в норме и при патологии интересно исследовать ее активность у пренатальной алкоголизированных животных обоего пола.

1.4. Регуляторные пептиды и ферменты их обмена в онтогенезе

Содержание биологически активных пептидов изменяется в процессе индивидуального развития организма. Эти возрастные изменения отличаются в разных органах, тканях и группах клеток. Причем наблюдается отличие онтогенетической динамики изменения уровней разных пептидов в одной ткани и одного и того же пептида в разных тканях. Несомненно, это связано с различной биологической ролью разных пептидов в пределах одной ткани и вовлечением одного и того же пептида в протекание разных процессов в разных тканях [52, 55, 76]. В онтогенезе существенно изменяются соотношения между уровнем биологически активных пептидов и их предшественников [266], или соотношение между уровнем пептидов, происходящих из одного предшественника [181, 310], что свидетельствует об изменении специфичности процессинга предшественников в ходе индивидуального развития.

мРНК препроэнкефалина в мозге крыс обнаруживается на Е15, сохраняется на этом уровне до Р14, а затем возрастает до уровня взрослых животных [351]. Продукты расщепления проэнкефалина обнаруживаются на ранних стадиях эмбрионального развития в мозге крыс [342]. Met-энкефалин появляется в мозге крыс на Р0, его уровень увеличивается к Р21 и далее медленно возрастает [347]. По другим данным [25, 267], его уровень повышается в гипофизе, снижается в коре головного мозга, гипоталамусе и спинном мозге, не изменяется в гиппокампе и стволе мозга. Leu-энкефалин появляется в гиппокампе крыс на Р4, его содержание увеличивается к Р18, в среднем мозге не изменяется [118].

В надпочечниках крыс в возрасте Р7-Р21 изменяется соотношение предшественник/зрелая форма Met-энкефалина, очевидно за счет изменения процессинга проформы. Это подтверждается и повышением активности КПН, которая вовлекается в его превращение [266]. При этом содержание Met-энкефалина-Arg⁶-Phe⁷ снижается в 4 раза, а Met -энкефалина – в 2 раза [266].

Содержание β-эндорфина в отделах мозга (гиппокампе, гипоталамусе, коре), как правило с возрастом снижается, а в гипофизе – увеличивается [25, 267]. Предполагают, что эти изменения связаны с возрастными особенностями формирования гипоталамо-гипофизарной системы.

У детей, подростков и взрослых обоих полов концентрация АКГТ в плазме крови практически одинакова, а концентация β-липотропина и β-эндорфина возрастает в препубертатном периоде и к началу полового созревания достигает величин, характерных для взрослых [181]. Т. к. эти пептиды происходят из единого предшественника – проопиомеланокортина [247], то избирательное изменение их концентрации может происходить только за счет изменения специфичности процессинга или изменения скорости деградации.

Пролактин обнаруживается в передней доле гипофиза крыс с Е17, его уровень не изменяется до Е21, резко увеличивается с Р1 до Р10. В сыворотке крови концентрация пролактина растет с Е17 до Е21 и снижается с Р1 до Р10 [275].

ВИП обнаруживается в мозге крыс на Е17, уровень его достигает минимума к Р20, а затем медленно повышается [254]. В заднем мозге крыс ВИП обнаруживается на Р4, его концентрация достигает максимума к Р18 [119, 159]. Его уровень в слюнных железах, как и вещества Р, волнообразно увеличивается в первые 8 недель развития крыс [158].

Нейропептид Y появляется в коре и подкорковых ядрах крыс на Е19, его уровень увеличивается к Р0 и далее не изменяется [162, 349]. В тазовом сплетении спинного мозга крыс этот пептид обнаруживается на Е18 [328].

Уровень нейротензина в гипоталамусе крыс возрастает от Р0 до Р19 [307].

Возрастные изменения уровня нейропептидов сильно зависят от пола животных, особенно в период полового созревания. Это связано с тем, что многие биологически активные пептиды вовлекаются в регуляцию уровня половых гормонов и в регуляцию функционирования половой системы [12, 94, 95]. Показано также, что изменение уровней половых гормонов вызывает изменение уровня различных нейропептидов, в том числе β-эндорфина, кортикотропин-подобного пептида, α-меланотропин-стимулирующего гормона, вещества Р [156, 346].

Обнаруженные к настоящему времени возрастные изменения уровня регуляторных пептидов, вероятно, связаны с изменениями в функционировании ферментных систем, участвующих в их синтезе и деградации.

Активность Tyr-аминопептидазы в коре головного мозга котят с возрастом повышается, а Asp- аминопептидазы – снижается [259].

Активность пироглутамил-пептидазы І снижается с Р9 до Р20 в гипоталамусе, стриатуме, коре и гипофизе крыс [179, 259]. Активность фермента с Р20 до Р25 не изменяется. При этом в гипоталамо-гипофизарной оси наблюдаются достоверные отличия активности фермента у самцов и самок всех исследованных возрастов.

Уровень пролин-иминопептидазы в сыворотке крови детей старше 1 года уменьшается до 20 лет и несколько повышается позже [258]. Половых отличий при этом не обнаружено.

Активность диппептидиламинолпептидазы ІV и аминопептидазы М в мозге и изолированных микрососудах мозга во время снижается во время первых 8 недель постнатального развития. Активность аминопептидазы А снижается к Р14, а затем к 8 неделям возвращается к исходному уровню. При этом обнаружены половые отличия [129, 180].

Активность нейтральной эндопептидазы 24.11 в гипоталамусе крыс повышается с Р0 до Р7 и далее не изменяется, в коре больших полушарий она повышается с Р0 до Р30, а в мозжечке – снижается и далее не изменяется [278].

Активность металлоэндопептидазы 24.15 в коре повышается от Р0 до Р7, к Р90 возвращается к исходному уровню. В гипоталамусе и мозжечке уровень фермента постоянен в периоде Р0-Р30 и снижается к Р90 [278].

Уровень АПФ в стриатонигральном тракте и коре больших полушарий крыс возрастает от Р0 до Р20, а затем несколько снижается [326].

Активность КПН изменяется с возрастом. У эмбрионов крыс мРНК КПН экспрессируется как в нервной (таламус, гипоталамус, средний и продолговатый мозг, кортикальная пластинка и спинной мозг, а также периферические ганглии), так и в других тканях (сердце и первичные хрящи) [353]. В постнатальном периоде активность КПН у крыс обоего пола повышается, причем динамика изменения активности фермента в отделах мозга и периферических тканях различается [41, 142, 278]. Нужно отметить расхождения данных, опубликованных разными авторами, касающихся изменения активности КПН в одних и тех же отделах мозга в постнатальном периоде, что, вероятно, связано с различиями в экспериментальной методике.

Наибольшие различия (в частности, в гипоталамусе) отмечены непосредственно в период полового созревания. Начиная с 90-дневного возраста, достоверные половые различия в активности данного фермента обнаружены лишь в почках и половых железах. Особенно это выражено у 120-дневных крыс [101].

Имеются данные о возрастных изменениях активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в мозге и периферических тканях самцов крыс в период с рождения до 120-дневного возраста [41]. Причем в тканях с наибольшим содержанием данного фермента (гипофизе, семенниках, надпочечниках) отмечается снижение его активности с возрастом. Влияние возраста на активность фермента более выражено в мозге и тканях самцов, чем у самок [41, 101, 102]. Динамика возрастных изменений у животных разного пола в большинстве случаев совпадает.

Таким образом, приведенные сведения указывают на возможность вовлечения ферментов обмена физиологически активных пептидов в регуляцию онтогенетических изменений уровня этоих пептидов, а также в определение их половых различий. И представляется интересным исследование возрастной динамики ферментативной активности (в частности КПН и ФМСФ-КП) у крыс обоего пола, испытавших алкоголизацию в эмбриональном периоде.

* * *

Суммируя все выше изложенное, можно заключить:

В процессе онтогенеза в организме происходят значительные изменения обмена регуляторных пептидов и ферментов их обмена.

Важная роль в обмене пептидов принадлежит основным карбоксипептидазам. Они участвуют в конечной стадии процессинга неактивных предшественников пептидов и в начальных стадиях их инактивации, тем самым, контролируя уровень и соотношение биологически активных пептидов в организме.

Хроническая алкоголизация изменяет уровни и соотношение различных регуляторных пептидов (в первую очередь опиоидных пептидов, выполняющих важную роль в патогенезе алкоголизма) и активность ферментов их обмена.

Пренатальное воздействие этанола изменяет содержание регуляторных пептидов (в том числе и опиоидных) и формирует предрасположенность к развитию алкоголизма.

Все отмеченные изменения зависят от пола.

Представляет интерес сравнительное изучение активности основных карбоксипептидаз в тканях самок и самцов крыс, испытавших эмбриональное воздействие этанола, исследование активности этих ферментов при последующем постнатальном хроническом воздействии этанола. Эти данные могут иметь важное значение для выяснения биологической роли основных карбоксипептидаз в организме при алкоголизме, для понимания механизмов развития возрастных и половых отличий активности ферментов и уровней регуляторных пептидов при этом заболевании, механизмов формирования этанольной зависимости у потомков алкоголиков.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы исследования

Опыты проводили на новорожденных, а также в возрасте 14, 28, 45, 120 суток после рождения, самках и самцах белых беспородных крыс. Животных содержали в стандартных условиях вивариума.

Животных декапитировали, извлекали головной мозг, гипофиз, надпочечники и половые железы. Ткани помещали в охлажденный физиологический раствор, очищали от оболочек и кровеносных сосудов, высушивали фильтровальной бумагой. Затем выделяли отделы мозга - гипоталамус и стриатум у всех крыс, а также четверохолмие, гиппокамп и большие полушария у животных в возрасте 120 суток.

Характеристики

Список файлов ВКР