Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 5)

Образцы выделенных тканей гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера в 20 мМ натрий ацетатном буфере (рН 5,6), содержащем 50 мМ NaCl, в соотношении 1:100 (вес:объем). Гомогенаты использовали в качестве источников КПН и ФМСФ-КП.

В качестве специфических ингибиторов применяли ФМСФ (”Serva”, США) и ГЭМЯК (“Serva”, США). В качестве субстратов использовали дансил-Phe-Ala-Arg и дансил-Phe-Leu-Arg. Все остальные реактивы были отечественного производства с квалификацией ”ХЧ” и ”ОСЧ”.

2.2. Методы исследования

2.2.1. Моделирование хронического потребления этанола.

Для исследования онтогенетических изменений активности основных карбоксипептидаз при внутриутробном хроническом воздействии этанола использовали две группы животных: пренатально алкоголизированную (Э) и контрольную (К). Животные пренатально алкоголизированной группы являлись потомством самок, получавших в течение всего периода беременности в качестве единственного источника жидкости 12 % раствор этанола, содержащий 5 % сахарозы; контрольной группы – потомством самок, получавших в этот период только 5 % раствор сахарозы.

Кроме того, для исследования активности данных ферментов при последующей постнатальной алкоголизации крыс, подвергнутых влиянию этанола в эмбриональном периоде, взрослых животных каждой группы разделили на две подгруппы: постнатально алкоголизированную и контрольную. Животные постнатально алкоголизированной подгруппы получали в течение 15 суток в качестве единственного источника жидкости 12% раствор этанола, содержащий 5% сахарозы; крысы контрольной подгруппы – 5% раствор сахарозы. Таким образом, было сформировано четыре подгруппы взрослых животных: контрольная (КК), пренатально алкоголизированная (ЭК), постнатально алкоголизированная (КЭ), пренатально и постнатально алкоголизированная (ЭЭ).

2.2.2. Метод определения активности ферментов

Активность ферментов определяли флюорометрическим методом по Fricker L. D., Snyder S. H. [330].

Для определения активности КПН 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (контрольная проба) натрий-ацетатного буфера или к смеси 140 мкл буфера и 10 мкл 25 мкМ водного раствора ингибитора ГЭМЯК (опытная пробя). При определении активности ФМСФ-КП использовали ту же схему, с той лишь разницей, что в качестве ингибитора использовали 25 мМ спиртовой раствор ФМСФ, который добавляли после смешивания гомогената ткани с буфером.

Пробы преинкубировались 8 мин при 37^оС.

Реакцию начинали прибавлением 50 мкл 210 мкМ субстрата – дансил-Phe-Ala-Arg для определения активности КПН или дансил-Phe-Leu-Arg для определения активности ФМСФ-КП (конечная концентрация субстратов в реакционной смеси составляла 42 мкМ). Далее пробы инкубировали 60 мин при 37оС. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1 М раствора соляной кислоты. Для экстракции продукта реакции – дансил-Phe-Ala или дансил-Phe-Leu – к пробам приливали 1,5 мл хлороформа и встряхивали в течение 60 с. Для разделения фаз пробы центрифугировали 5 мин при 1000 g. Измерение флюоресценции хлороформной фазы проводили на флюориметре ФМЦ-2 в кювете толщиной 1 см при _ex=360 нм и _em=530 нм. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-Phe-Ala в хлороформе.

Активность ферментов определяли как разность в накоплении продукта реакции в пробах, не содержащих и содержащих ингибитор, и выражали в нмоль дансил-Phe-Ala или дансил-Phe-Leu, образовавшихся за 1 мин инкубации, в пересчете на 1 мг белка.

Содержание белка в пробах определяли по методу Lowry и соавт. [244].

2.2.3. Метод проведения теста «открытое поле»

Взрослых животных в возрасте 120 дней однократно тестировали по методу «открытое поле» [73]. Для этого животных помещали на ярко освещенную площадку (100х100 см), разделенную на квадраты (20х20 см). В течение 5 минут оценивали следующие поведенческие параметры:

• количество посещений периферических квадратов;

• количество посещений центральных квадратов;

• суммарную двигательную активность (общее количество посещении периферических и цетральных квадратов);

• суммарную вертикальную активность (количество стоек);

• общую активность (суммарную двигательную и вертикальную активность);

Рассчитывали отношение суммарной двигательной к суммарной вертикальной активности.

2.2.4. Статистическая обработка результатов исследования

Экспериментальные данные обрабатывали статистически. Достоверность отличий между средними определяли с использованием t-критерия Стьюдента [68]. Корреляционный и дисперсионный анализы проводили с помощью программы Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США) в режимах Simple Correlation, One-Way ANOVA и Multifactor ANOVA. Принадлежность подгрупп животных к разным гомогенным группам оценивали с помощью Multiple range analysis (Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США)). Принадлежность возрастных подгрупп к разным гомогенным группам проводили только в случае достоверности критерия Фишера. При этом оценивали количество гомогенных групп, образуемых экспериментальными подгруппами, с уровнем достоверности р<0,05. Баллы подгруппам присваивали на основании их принадлежности к разным гомогенным группам по мере увеличения среднего. При этом минимальный балл получала временная подгруппа с минимальным средним, максимальный балл – временная подгруппа с максимальным средним, а дробный балл (1,5) получали подгруппы, входящие одновременно в две гомогенные группы. На основании присвоенных баллов делали вывод о динамике изменения активности ферментов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Исследование активности основных карбоксипептидаз в тканях крыс разного возраста, испытавших пренатальное воздействие этанола

3.1.1. Исследование активности карбоксипептидазы Н в тканях пренатально алкоголизированных крыс разного возраста

Согласно данным дисперсионного анализа пренатальное воздействие этанола достоверно влияло на активность КПН в стриатуме, надпочечниках и семенниках самцов, в гипоталамусе, стриатуме и надпочечниках самок (табл. 1).

Табл. 1. Дисперсионный анализ влияния пренатальной алкоголизации на активность КПН в тканях животных разного возраста (значения критерия Фишера F_Ф).

Примечание: здесь и в табл. 2-8, 11, 12: n = 5÷8; достоверность критерия Фишера * – р < 0,05, ** – р < 0,01, *** – р < 0,001.

При этом у самцов наблюдалось достоверное снижение активности КПН в стриатуме в возрасте Р0 и Р14 (рис. 1), в гипофизе в возрасте Р14, в надпочечниках в возрасте Р28 и Р120, в семенниках в Р0 и Р120 (рис. 2) по сравнению с интактными животными. У пренатально алкоголизированных самок наблюдалось достоверное снижение активности КПН в гипоталамусе в Р0, Р14, Р28, в стриатуме в Р14, Р45 (рис. 3), в гипофизе в Р0, в надпочечниках и яичниках в Р0 (рис. 4); увеличение активности в гипоталамусе (рис. 3) и в гипофизе в Р120 (рис. 4). Во всех остальных случаях изменений ферментативной активности не выявлено.

Наиболее существенные изменения активности КПН (40% – 50%) наблюдались в стриатуме, гипофизе, половых железах животных обоего пола и гипоталамусе самок на ранних этапах постнатального развития, а так же в надпочечниках самцов в Р28 и Р120, в семенниках в Р120, в гипофизе самок в Р120 (113%).

По данным дисперсионного анализа активность КПН достоверно зависела от возраста во всех тканях животных, кроме гипоталамуса самок (табл. 3) и семенников самцов алкоголизированных групп, а также гипоталамуса самцов контрольной и алкоголизированной групп (табл. 2).

Табл. 2. Дисперсионный анализ влияния возраста на активность КПН в тканях самцов крыс (значения критерия Фишера F_Ф, баллы возрастных групп).

Табл. 3. Дисперсионный анализ влияния возраста на активность КПН в тканях самок крыс (значения критерия Фишера F_Ф, баллы возрастных групп).

В стриатуме интактных самок (рис. 3) активность КПН значительно повышалась от Р0 к Р14, а затем постепенно снижалась к Р120 практически до исходного уровня. При пренатальной алкоголизации активность фермента постепенно повышалась от Р0 к Р28, а затем снижалась к Р45 – Р120 до уровня Р28.

В гипофизе интактных самок (рис. 4) активность КПН повышалась от Р0 к Р14 – Р45, а затем вновь снижалась до исходного уровня. У пренатально алкоголизированных самок активность фермента также повышалась от Р0 к Р14 – Р45, но не уменьшалась к Р120.

У интактных самок в надпочечниках (рис. 4) активность фермента существенно повышалась от Р0 к Р14, а затем постепенно снижалась к Р120 до исходного уровня; в яичниках (рис. 4) активность КПН значительно снижалась от максимального уровня в Р0 – Р14 к Р28 – Р120. У алкоголизированных самок возрастная динамика изменения активности фермента в надпочечниках и яичниках была сходна с интактными крысами.

Таким образом, у пренатально алкоголизированных животных отмечалось нарушение возрастной динамики изменения активности КПН.

Активность КПН зависела от пола в гипофизе интактных животных, в гипоталамусе и надпочечниках алкоголизированных животных (табл. 4). Ферментативная активность зависела от взаимодействия пола и возраста во всех тканях контрольных животных, кроме надпочечников, а также в гипофизе и надпочечниках алкоголизированных крыс (табл. 4). Влияние пола у алкоголизированных животных меньше зависело от возраста, чем у контрольных.

Табл. 4. Дисперсионный анализ влияния пола и взаимодействия пола и возраста на активность КПН (значения критерия Фишера: F_Ф1– влияние пола, F_Ф2 – взаимодействие влияния пола и возраста).

У контрольных самок в гипоталамусе, по сравнению с самцами, активность КПН была выше в Р14, ниже в Р120 и одинаковой в остальные возрастные периоды. У пренатально алкоголизированных самок – ниже в Р28 и не отличалась в других возрастных группах от контрольных самцов (рис. 1, 3).

В стриатуме контрольных самок активность КПН была выше, чем у самцов в Р14 и Р45, но не отличалась у алкоголизированных крыс в течение всего исследуемого периода (рис. 1, 3).

У интактных самок, по сравнению с самцами, активность КПН в гипофизе была одинаковой в Р0, выше в Р14 и ниже в Р28 – Р120; у пренатально алкоголизированных – ниже в Р0 – Р14, не отличалась в Р28 – Р45 и выше в Р120.

В надпочечниках интактных самок ферментативная активность была одинаковой в Р0, Р45 и Р120, выше в Р14 и ниже в Р28 по сравнению с интактными самцами; у алкоголизированных самок – ниже в Р0, выше в Р14 и Р28, одинаковой в Р45 и Р120 (рис. 2, 4).

В яичниках контрольных самок активность исследуемого фермента была ниже в Р45 и Р120 по сравнению с семенниками самцов. У алкоголизированных животных обоего пола активность КПН в половых железах была одинаковой с Р0 по Р120 (рис. 1-2).

Т. е., при внутриутробном воздействии этанола произошло изменение полового соотношения активности КПН. В некоторых случаях (в гипоталамусе в Р14 и Р120, в стриатуме в Р14 и Р45, в гипофизе в Р28 и Р45, в половых железах в Р45 и Р120) активность КПН стала одинаковой у животных разного пола, в других (в гипоталамусе в Р28 и в гипофизе в Р0) у самок активность КПН стала ниже, чем у самцов, а в гипофизе в Р120 и в надпочечниках в Р28 половые отличия сохранились, но соотношение активности стало противоположным.

Таким образом, полученные результаты показывают, что у контрольных животных активность КПН изменялась с возрастом практически во всех тканях. Причем наибольшая ферментативная активность отмечалась у самцов в Р28 во всех тканях (кроме семенников), в семенниках в Р120, а у самок в Р14 во всех тканях. Это согласуется с литературными данными о наиболее существенных изменениях у самок крыс в инфантильном периоде (с Р8 по Р21), у самцов – в ювенильном (с Р21 по Р32) и препубертатном (после Р32) периодах [12]. Это подтверждает ранее высказанное предположение о вовлечение КПН в процесс пубертации и формирование половых отличий [88, 101].

Возрастная динамика активности КПН в отделах мозга отличалась от таковой в периферических тканях. Вероятно, это объясняется вовлечением изучаемого фермента в метаболизм разных пептидов в мозге и в периферических тканях [41, 124, 174].

При влиянии пренатальной алкоголизации наблюдалось нарушение возрастной динамики изменения активности КПН. Причем у самок наиболее существенно она нарушалась в гипоталамусе и стриатуме, а у самцов – в надпочечниках и семенниках. Возможно, пренатальная алкоголизация, изменяя уровень активности КПН – одного из ферментов обмена биологически активных пептидов, у самок нарушала формирование и функционирование отделов ЦНС, а у самцов – периферических звеньев ГГНС и ГГГС [109, 114, 177, 182, 190, 191, 208, 269, 280, 281, 282, 291, 313].

Изменение активности КПН в тканях эмбрионально алкоголизированных животных в разные возрастные периоды происходило преимущественно в сторону снижения. И только в гипофизе и гипоталамусе самок в Р120 активность КПН увеличилась. Причем в гипоталамусе (отделе, играющем важнейшую роль в патогенезе алкоголизма) самок наблюдались отличия практически в течение всего периода онтогенеза. Тогда как у самцов в этом отделе изменения активности КПН с Р0 до Р120 не выявлены.

Внутриутробное воздействие этанола вызвало нарушение половых отличий активности данного фермента, что, вероятно, связано с нарушением процесса пубертации и формирования половых отличий у потомков алкоголиков [109, 138, 177, 239, 264, 265, 271, 280, 281].

3.1.2. Исследование активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях пренатально алкоголизированных крыс разного возраста

Согласно данным дисперсионного анализа пренатальное воздействие этанола достоверно влияло на активность ФМСФ-КП в яичниках самок (табл. 5).

Табл. 5. Дисперсионный анализ влияния пренатальной алкоголизации на активность ФМСФ-КП тканях животных разного возраста (значения критерия Фишера F_Ф)

При этом у самцов (рис. 5, 6) наблюдалось достоверное снижение активности ФМСФ-КП в стриатуме в Р14 и Р120, в гипофизе и семенниках в Р14.

У пренатально алкоголизированных самок активность ФМСФ-КП была ниже во всех исследованных тканях в Р14 и в яичниках в Р120, и была выше в гипофизе в Р120 (рис. 7, 8) по сравнению с интактными самками. Во всех остальных случаях изменений ферментативной активности не выявлено.

Наиболее существенные изменения активности ФМСФ-КП (23% – 48%) наблюдались в гипофизе, стриатуме, половых железах самцов и во всех тканях самок на ранних этапах постнатального развития, а также в яичниках самок в Р120.

По данным дисперсионного анализа возраст достоверно влиял на ФМСФ-КП во всех отделах и тканях животных обоего пола контрольной и алкоголизированной групп, кроме гипоталамуса и яичников алкоголизированных самок (табл. 6, 7).

Табл. 6. Дисперсионный анализ влияния возраста на активность ФМСФ-КП в тканях самцов крыс (критерий Фишера F_Ф, баллы возрастных подгрупп).

При этом наблюдалась следующая возрастная динамика активности ФМСФ-КП. В гипоталамусе самцов активность ФМСФ-КП повышалась к Р14 у интактных и к Р14 – Р28 у алкоголизированных крыс, и значительно снижалась к Р120 у обеих групп (рис. 5).

В стриатуме контрольных самцов активность фермента плавно уменьшалась от максимального значения в Р0 – Р14 к Р120; у алкоголизированных самцов активность ФМСФ-КП была наибольшей в Р28 и наименьшей в Р120 (рис. 5).

В гипофизе контрольных самцов активность ФМСФ-КП повышалась от Р0 до максимального значения к Р14, затем снижалась к Р28, вновь, но в меньшей степени, повышалась к Р45, а к Р120 стала ниже исходного уровня. В гипофизе алкоголизированных самцов динамика изменения ферментативной активности практически не отличалась от интактных животных (рис. 6).

Табл. 7. Дисперсионный анализ влияния возраста на активность ФМСФ-КП в тканях самок крыс (критерий Фишера F_Ф, баллы возрастных подгрупп).

В надпочечниках интактных и опытных самцов ферментативная активность плавно уменьшалась от Р0 – Р14 к Р28 – Р120 (рис. 6).

В семенниках контрольных самцов активность исследуемого фермента повышалась от Р0 до максимального уровня в Р14, значительно снижалась к Р28 – Р45, а в Р120 стала минимальной. У пренатально алкоголизированных самцов активность ФМСФ-КП незначительно изменялась в Р0 – Р45 и снизилась к Р120 (рис. 6).

Также как и у самцов, пренатальная алкоголизация вызывала достоверные более или менее существенные нарушения возрастной динамики активности ФМСФ-КП практически во всех тканях самок. Если у контрольных самок возрастная динамика имела пик активности в Р14 во всех тканях, а в надпочечниках еще и в Р0, и яичниках в Р120, то у алкоголизированных самок таких выраженных пиков не было практически нигде.

В гипоталамусе и стриатуме интактных самок (рис. 7) ферментативная активность увеличивалась от Р0 к Р14 и плавно уменьшалась к Р120. У алкоголизированных самок в этих отделах активность ФМСФ-КП менее значительно изменялась с возрастом на ранних этапах онтогенеза, но была несколько выше в Р28 в гипоталамусе и в Р14 – Р28 в стриатуме по сравнению с другими возрастными группами.

В гипофизе интактных самок (рис. 8) активность данного фермента существенно изменялась в период с рождения до Р120. При этом отмечалось два пика активности – наибольший в Р14, и меньше – в Р45. В гипофизе алкоголизированных самок активность ФМСФ-КП незначительно изменялась с возрастом, с несколько большим уровнем активности в Р14.

В надпочечниках контольных и алкоголизированных самок активность ФМСФ-КП была наибольшей в Р0 – Р14 и наименьшей в Р28 и Р120 у интактных крыс, и наибольшей в Р0 и наименьшей в Р120 у алкоголизированных крыс (рис. 8).

В яичниках интактных самок активность ФМСФ-КП была минимальной в Р0, Р28 и Р45, значительно возрастала в Р14 и еще больше в Р120 (рис. 8).

Пол и взаимодействие пола и возраста достоверно влияли на активность ФМСФ-КП в половых железах интактных и алкоголизированных животных, а также в гипофизе интактных крыс (табл. 8).

У контрольных животных активность ФМСФ-КП была достоверно выше у самок, чем у самцов в стриатуме и гипофизе в Р14 и Р45, а также в половых железах в Р28-120. При алкоголизации в эмбриональном периоде, активность ФМСФ-КП в стриатуме и гипофизе в Р14 и Р45 выравнялась у животных разного пола, а в гипофизе в Р120 и половых железах в Р0 она стала выше у самок, чем у самцов. При снижении активности ФМСФ-КП в яичниках в Р120, она все равно осталась выше (в 10 раз), чем в семенниках (рис. 5-8).

Табл. 8. Дисперсионный анализ влияния пола и взаимодействия влияния пола и возраста на активность ФМСФ-КП (значения критерия Фишера: FФ1– влияние пола, FФ2 – взаимодействие влияния пола и возраста).

Таким образом, максимальные значения активности ФМСФ-КП у контрольных животных обоего пола отмечались во всех тканях на ранних этапах постнатального развития (в основном в Р14, иногда в Р0-Р14), а также в яичниках самок в Р120. Это, вероятно, свидетельствует о том, что, ФМСФ-КП наиболее активно вовлекается в обмен регуляторных пептидов на ранних этапах постнатального развития и в яичниках в Р120. Наиболее существенные изменения активности ФМСФ-КП при пренатальной алкоголизации наблюдались в эти же возрастные периоды. Это, очевидно, отражает нарушение процесса развития и полового созревания потомков алкоголиков [109,138, 177, 239, 264, 265, 271, 280, 281].

У пренатально алкоголизированных животных отмечалось нарушение возрастной динамики изменения активности ФМСФ-КП. Причем у самцов она существенно изменялась в стриатуме и семенниках, а у самок – во всех тканях, кроме надпочечников. Возможно, пренатальная алкоголизация, изменяя уровень активности ФМСФ-КП, нарушала формирование и функционирование пептидергических систем в этих тканях.

В железах внутренней секреции крыс обоего пола активность ФМСФ-КП, как правило, была в несколько раз выше, чем в отделах мозга. Вероятно, это объясняется тем, что в периферических отделах ГГНС и ГГГС исследуемому ферменту принадлежит более значимая функция в обмене биологически активных пептидов, чем в отделах ЦНС.

При достоверном влиянии пола и взаимодействия пола и возраста, пренатальная алкоголизация явилась причиной того, что в гипофизе и стриатуме в Р14 и Р45 активность ФМСФ-КП стала практически одинаковой у животных разного пола, тогда как в норме ферментативная активность у самок была выше, чем у самцов. В яичниках и семенниках половое соотношение активности ФМСФ-КП в Р28 – Р120 сохранилось (у самок выше, чем у самцов), но в Р0 в половых железах и в Р120 в гипофизе стала выше у самок, чем у самцов.

Наиболее существенные изменения половых отличий активности ФМСФ-КП на разных стадиях развития у пренатально алкоголизированных животных отмечены в гипофизе – эндокринной железе, играющей важнейшую роль в гормональной регуляции всего организма [12, 95], что, вероятно, является одной из причин нарушения развития потомков алкоголиков.

3.2. Исследование влияния хронической алкоголизации
на активность основных карбоксипептидаз в тканях взрослых крыс, испытавших пренатальное воздействие этанола

Для понимания механизмов влияния пренатальной алкоголизации на формирование предрасположенности к развитию алкоголизма у человека и животных представляет интерес исследование активности ферменов обмена регуляторных пептидов, в том числе и опиоидных пептидов, в отделах мозга и периферических тканях взрослых крыс, перенесших внутриутробную алкоголизацию, при последующем хроническом воздействии этанола. Немаловажным также является вопрос о половых отличиях при этом.

3.2.1. Исследование поведения пренатально алкоголизированных животных в тесте «открытое поле»

Методика «открытого поля», внедренная в практику лабораторных исследований Hall C.S. в 1934 г. [194], позволяет количественно оценить моторную активность крыс и мышей по двум основным компонентам: вертикальному – стойки и горизонтальному – локомоции. Регистрация отдельных форм поведения (заход в центр, неподвижность, количество болюсов и т. д.) при всей трудности интерпритации может дать весьма точную первичную характеристику состояния животного (страх, возбуждение, навязчивое поведение, снижение или повышение ориентировочной реакции и т. д.) [194]. Количество локомоций и стоек широко варьирует у разных животных, но обычно прослеживается определенная структура, характеризующая двигательное поведение группы животных в целом. В частности, такую информацию несет вычисляемое соотношение между двигательной (локомоции) и вертикальной (стойки) активностью [194].

Несмотря на некоторую несогласованность опубликованных данных об изменении поведения животных, подвергнутых алкоголизации в эмбриональном периоде [70, 83, 153, 241, 281, 299, 309], нас при проведении эксперимента интересовало наличие таких изменений, влияние на них последующей алкоголизации и половые отличия при этом.

У контрольных животных не было выявлено половых отличий исследованных поведенческих параметров (табл. 9, 10).

Табл. 9. Параметры поведения в тесте «открытое поле» взрослых самцов крыс.

Здесь и в табл. 10: КК – параметры поведения контрольных подгрупп животных, ЭК – пренатально алкоголизированных подгрупп, КЭ – постнатально алкоголизированных подгрупп, ЭЭ – пренатально и постнатально алкоголизированных подгрупп; M ± m; n = 12; достоверность отличий * – р < 0,05; * * – р < 0,01, ; * * * – р < 0,001 относительно контроля; ^{Х Х Х} – р < 0,001 относительно ЭК, ⁺ – р < 0,05; ^{+ +} – р < 0,01, ^{+ + +} – р < 0,001 относительно самцов.

У пренатально алкоголизированных животных обоего пола отмечено увеличение подвижности (табл. 9, 10). Причем у самок все параметры увеличились в большей степени (в 2-3 раза), чем у самцов (в 2 раза). Суммарная двигательная активность увеличилась в основном за счет увеличения частоты посещений периферических квадратов. У самок в отличие от самцов, также увеличилось количество вертикальных стоек, являющихся показателем исследовательской активности и/или страха.

Табл. 10. Параметры поведения в тесте открытого поля взрослых самок крыс.

Соотношение «суммарная двигательная активность:суммарная вертикальная активность», которая у контрольных животных была 2:1, мало изменилась у самцов (табл. 9), а у самок стала 3:1 (табл. 10).

Постатальное воздействие этанола на животных, не подвергавшихся пренатальной алкоголизации, не влияло на поведение самок. У самцов же произошли изменения, аналогичны тем, которые были отмечены у пренатально алкоголизированных животных. Соотношения суммарных активностей были у самцов – 4:1 (табл. 9), у самок – 2:1 (табл. 10).

Последующая алкоголизация животных, подвергавшихся воздействию этанола во внутриутробном периоде, также по-разному повлияла на поведение самцов и самок (табл. 9, 10). У самцов подвижность резко снижалась и по некоторым показателям стала достоверно ниже не только пренатально алкоголизированных, но и интактных самцов. Соотношение двух видов активности у самцов стало 1,5;1 (табл. 9). Подвижность самок, а, следовательно, и соотношение суммарных двигательной и вертикальной активностей, была такой же, как и у самок, подвергавшихся только пренатальной алкоголизации. Суммарная вертикальная активность – показатель реакции страха или исследовательской активности [72, 74] – вернулась практически к норме.

Результаты теста отразили то, что пренатальная алкоголизация усугубляла нарушение поведенческих реакций у взрослых самцов при хроническом воздействии этанола. На самок пренатальная алкоголизация такого эффекта не оказывала.

3.2.2. Исследование влияния хронической алкоголизации на активность карбоксипептидазы Н в тканях взрослых крыс, испытавших пренатальное воздействие этанола

В табл. 11 и на рис. 9-12 представлены результаты исследования активности КПН при пренатальной, постнатальной и обоих вместе видах алкоголизации крыс обоего пола.

Пол достоверно влиял на активность КПН в гипофизе, гипоталамусе, гиппокампе, четверохолмие и половых железах (табл. 11). У интактных самок в этих тканях активность фермента была достоверно ниже, чем у самцов.

Согласно данным дисперсионного анализа пренатальная алкоголизация влияла на активность КПН во всех отделах, кроме стриатума и гиппокампа (табл. 11). В четверохолмие, надпочечниках и семенниках самцов, испытавших внутриутробное воздействие этанола, активность КПН была ниже, чем у контрольных самцов (рис. 9, 10). У пренатально алкоголизированных самок в гипоталамусе и гипофизе активность была выше, а в четверохолмие ниже, чем у контрольных самок (рис. 11, 12).

Взаимодействие пренатальной алкоголизации и пола влияло на активность исследованного фермента в гипофизе, стриатуме и половых железах (табл. 11).

Пренатальная алкоголизация вызывала изменение активности КПН в разных тканях у самцов и самок: у самцов в четверохолмие, надпочечниках и семенниках; у самок в гипоталамусе, четверохолмие и гипофизе. Причем у самцов активность КПН снижалась во всех указанных отделах, а у самок повышалась в гипоталамусе и гипофизе и снижалась в четверохолмие.

При этом наблюдалось выравнивание ферментативной активности у животных разного пола в гипоталамусе, четверохолмие и половых железах, а в гипофизе самок активность КПН стала выше, чем у самцов.

Постнатальная алкоголизация влияла на активность КПН во всех тканях, кроме больших полушарий и гипофиза. Взаимодействие влияния постнатальной алкоголизации и пола на активность КПН было отмечено в гипоталамусе, четверохолмие, гипофизе и половых железах (табл. 11).

Табл. 11. Дисперсионный анализ влияния пола, пренатальной алкоголизации, постнатальной алкоголизации и их взаимодействия на активность КПН в тканях взрослых животных.

Примечание: здесь и в табл. 12 значения критерия Фишера: F_Ф1 – влияние пола, F_Ф2 – влияние пренатальной алкоголизации, F_Ф3 – влияние взаимодействия пренатальной алкоголизации и пола, F_Ф4 –влияние постнатальной алкоголизации, F_Ф5 – влияние взаимодейстия постнатальной алкоголизации и пола, F_Ф6 – влияние взаимодействия пренатальной и постнатальной алкоголизации.

У постнатально алкоголизированных самцов наблюдалось увеличение ферментативной активности в гипоталамусе и снижение в четверохолмии и семенниках по сравнению с контролем (рис. 9, 10). У постнатально алкоголизированных самок активность КПН была выше, чем у интактных самок, в гиппокампе, четверохолмии, гипофизе и яичниках (рис. 11, 12).

Таким образом, постнатальтная алкоголизация вызывала изменение активности КПН в разных тканях у животных разного пола: у самцов в гипоталамусе, четверохолмии и семенниках; у самок в гиппокампе, четверохолмии, гипофизе и яичниках. Причем у самок активность КПН повышалась во всех указанных отделах, а у самцов повышалась в гипоталамусе и снижалась в четверохолмии и семенниках.

При этом в гипофизе, гиппокампе, четверохолмии и половых железах постнатально алкоголизированных крыс, в отличие от контрольных, произошло выравнивание ферментативной активности у животных разного пола. В остальных тканях половое соотношение активности КПН осталось таким же, как у интактных подгрупп.

При сочетании пренатальной и постнатальной алкоголизации у самцов активность КПН в стриатуме и гиппокампе была выше, а в гипофизе и семенниках ниже, чем у самцов всех других подгрупп (КК, ЭК, КЭ). В гипоталамусе ЭЭ самцов активность фермента была выше по сравнению с контрольными и пренатально алкоголизированными самцами, но не отличалась от постнатально алкоголизированных. В четверохолмие и надпочечниках ЭЭ самцов активность КПН была выше, чем у пренатально алкоголизированных самцов, но не отличалась от контрольных и постнатально алкоголизированных. В больших полушариях самцов, подвергнутых пренатальной и постнатальной интоксикации, активность фермента была ниже по сравнению с контрольными и постнатально алкоголизированными самцами, но не отличалась от пренатально алкоголизированных (рис. 9, 10).

По сравнению с самками интактной подгруппы у ЭЭ самок активность КПН была выше в гипоталамусе, гиппокампе, гипофизе, яичниках и ниже в больших полушариях. По сравнению с пренатально алкоголизированными самками у самок ЭЭ подгруппы ферментативная активность была выше в стриатуме, гиппокампе, четверохолмии и яичниках. По сравнению с постнатально алкоголизированными самками у самок ЭЭ подгруппы активность исследуемого фермента была выше в гипоталамусе и ниже в четверохолми. В остальных слу чаях отличия ферментативной активности в тканях самок ЭЭ подгруппы от самок других подгрупп не наблюдались (рис. 11, 12).

У ЭЭ самок активность КПН была ниже в стриатуме, гиппокампе, четверохолмии и выше в гипофизе, яичниках по сравнению с самцами ЭЭ подгруппы.

Причем, в отличие от контроля половое различие ферментативной активности в гипоталамусе исчезло, в стриатуме появилось. В гипофизе и половых железах половое соотношение активности КПН стало противоположным по сравнению с интактными животными.

Таким образом, сочетание пренатальной и постнатальной алкоголизации вызвало по сравнению с контролем изменение активности КПН в большем количестве исследованных тканей, чем каждый из них в отдельности. Причем у эмбрионально алкоголизированных самцов действие постнатальной алкоголизации вызывало в большинстве исследованных тканей более существенные изменения ферментативной активности, чем каждый из этих видов интоксикации в отдельности. Постнатальная интоксикация эмбрионально алкоголизированных самок, напротив, приводила в большинстве тканей к меньшим или таким же изменениям активности КПН по сравнению с контролем, к каким приводило только постнатальное воздействие этанола. Т. е., пренатальная алкоголизация самок не являлась причиной большего влияния последующей постнатальной алкоголизации, что наблюдалось у самцов. Возможно, это свидетельствует о том, что пептидергические системы пренатально алкоголизированных самок, в отличие от самцов, более устойчивы к последующей этанольной интоксикации.

3.2.3. Исследование влияния хронической алкоголизации на активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях взрослых крыс, испытавших пренатальное воздействие этанола

В табл. 12 и на рис. 13-16 представлены результаты исследования активности ФМСФ-КП при отдельном и совместном влиянии пренатальной и постнатальной и алкоголизации на крыс обоего пола.

По данным дисперсионного анализа (табл. 12) пол достоверно влиял на активность ФМСФ-КП в четверохолмие, больших полушариях и половых железах. Пренатальное воздействие этанола достоверно влияло на активность ФМСФ-КП в гипофизе и половых железах. Взаимодействие влияния пола и пренатальной алкоголизации на активность фермента обнаружено в гиппокампе и половых железах.

При пренатальной алкоголизации у самцов не выявлены изменения активности ФМСФ-КП по сравнению с контрольной подгруппой (рис. 13, 14). У самок отмечено повышение активности в гиппокампе и гипофизе и снижение в яичниках по сравнению с интактными самками (рис. 15, 16).

У интактных самок активность ФМСФ-КП в стриатуме и половых железах была выше, чем у самцов. У пренатально алкоголизированных самок активность фермента была выше, чем у самцов, в больших полушариях, гипофизе и яичниках (рис. 13-16).

Постнатальное воздействие этанола влияло на активность ФМСФ-КП в гипоталамусе, стриатуме, больших полушариях, гипофизе и надпочечниках (табл. 12). При этом у самцов активность ФМСФ-КП была снижена по сравнению с контролем в четверохолмие и всех исследованных железах и имела тенденцию к снижению в остальных тканях (рис. 13-14). У самок активность ФМСФ-КП была снижена по сравнению с контролем в стриатуме, больших полушариях и всех исследованных железах (рис. 15-16).

Активность исследуемого фермента достоверно зависела от взаимодействия пола и постнатальной алкоголизации в гиппокампе и четверохолмие (табл. 12). У постнатально алкоголизированных самок активность ФМСФ-КП была выше, чем у КЭ самцов, в четверохолмие и половых железах (рис. 13-14).

По данным дисперсионного анализа ферментативную активность зависела от взаимодействия пренатальной и постнатальной алкоголизации в гипоталамусе (табл. 12).

Табл. 12. Дисперсионный анализ зависимости активности ФМСФ-КП от пола, пренатальной алкоголизации, постнатальной алкоголизации и их взаимодействия в тканях взрослых животных.

У ЭЭ самцов по сравнению с контрольными самцами ферментативная активность была снижена во всех тканях, кроме стриатума. По сравнению с пренатально алкоголизированными самцами она была снижена во всех тканях, кроме четверохолмия и гипофиза. По сравнению с постнатально алкоголизированными самцами у ЭЭ самцов ферментативная активность была снижена в гипоталамусе, гиппокампе, семенниках, увеличена в гипофизе и не отличалась в остальных тканях (рис. 13-14).

У ЭЭ самок по сравнению с контролем ферментативная активность была ниже в больших полушариях и гипофизе и выше в гиппокампе; по сравнению с пренатально алкоголизированными самками активность исследуемого фермента была ниже в больших полушариях и гипофизе; по сравнению с постнатально алкоголизированными самками – выше в гипофизе (рис. 15-16).

У ЭЭ самок во всех тканях, кроме четверохолмия и гипофиза, активность ФМСФ-КП стала выше, чем у ЭЭ самцов (рис. 13-16).

Таким образом, пренатальная алкоголизация по-разному влияла на активность фермента в разных тканях: активность увеличивалась в гиппокампе и гипофизе, снижалась в яичниках и не изменялась в остальных тканях. Это, вероятно, отражает дезинтегрирующее действие этанола на пептидергические системы, что проявляется, например, в избирательном изменении содержания опиоидных пептидов в разных тканях [69, 153, 263]. Причем, пренатальная алкоголизация по-разному влияла на активность ФМСФ-КП у самцов и самок: активность не изменялась у самцов, но изменялась у самок. Возможно, пренатальное воздействие этанола более существенно изменяет белковый обмен у самок.

Постнатальная алкоголизация снижала активность фермента во многих тканях животных обоего пола. Это согласуется с литературными данными о снижении скорости белкового обмена в различных органах и системах при хронической этанольной интоксикации [2, 23, 61, 98, 112]. Также, многие авторы отмечают снижение содержания опиоидных пептидов в отделах мозга [9, 18, 24, 84, 146, 348], что, по их мнению, является отражением процесса адаптации опиоидной системы к избыточной стимуляции, приводящей к снижению функциональной активности этой системы [9, 18, 84].

Но влияние хронической постнатальной алкогольной интоксикации на активность ФМСФ-КП отличалось в разных отделах мозга. Активность фермента достоверно снижалась или имела тенденцию к снижению в стриатуме и больших полушариях животных обоего пола и в четверохолмие самцов по сравнению с нормой. В остальных отделах активность не изменялась. Вероятно, это связано с несогласованным снижением уровней разных нейропептидов [9, 18, 24, 84, 146, 348,] и даже увеличением концентрации некоторых из них [98] под действием хронической алкоголизации в разных отделах мозга. Панченко Л. Ф. с соавт. [80] считают, что с такого дисбаланса в опиоидной системе мозга начинается формирование зависимости и толерантности к алкоголю, далее в процесс вовлекаются сопряженные с ней нейромедиаторные и нейромодуляторные системы мозга, что нарушает слаженную работу мозга в целом.

У самцов совместное действие пренатальной и постнатальной алкоголизации вызывали в большинстве исследованных тканей более существенные изменения ферментативной активности, чем каждый из этих видов интоксикации в отдельности. У самок пренатальная алкоголизация в большинстве тканей не приводила к усугублению изменений активности исследуемого фермента при последующем воздействии этанола. Это, возможно, может быть признаком меньшей восприимчивости пептидергических систем у эмбрионально алкоголизированных самок к воздействию этанола в постнальном периоде.

Совместное действие пренатальной и постнатальной алкоголизации, по-разному влияя на самцов и самок, вызывало появление половых отличий активности ФМСФ-КП в большинстве тканей, по сравнению с нормой и каждым видом интоксикации в отдельности.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Несмотря на разностороннее активное изучение проблем алкоголизма, биохимические механизмы многих нарушений, возникающих при этом, остаются мало понятны. Одним из основных направлений является исследование нарушений, возникающих у потомства алкоголиков. В настоящее время не вызывает сомнений, что хроническое потребление алкоголя матерью во время беременности пагубно отражается на всех системах организма, в том числе и на нейрогуморальной [3, 6]. При этом возможны два пути вредного влияния длительной алкогольной интоксикации:

• непосредственное токсическое воздействие в результате перехода этанола через плаценту [26];

• воздействие, опосредованное изменениями, возникающими под влиянием алкоголя в организме матери (нарушением нейроэндокринной регуляции, сдвигами метаболических процессов) [143, 227].

Одним из компонентов нейрогуморальной системы является пептидергическая система. Ее функционирование в значительной мере определяется пептид-гидролазами, к которым относятся КПН и ФМСФ-ингибируемая КП. Как известно, употребление алкоголя во время беременности, приводящее к эмбрио-фетогенезу, проявляется и на протяжении постнатального развития потомства [26, 64, 69, 70, 130, 138, 143]. Поэтому вызывает интерес рассмотрение постнатальных онтогенетических изменений активности пептид-гидролаз в организме эмбрионально алкоголизированных особей.

У интактных животных наибольшая активность КПН обнаруживается в тканях с высоким уровнем нейропептидов [103], а именно в гипофизе, в гипоталамусе и четверохолмие. Во многих тканях активность этого фермента достоверно ниже у самок, чем у самцов. Полученные нами данные согласуются с мнением о вовлечении КПН в процессинг регуляторных пептидов [163, 229, 344, 350]. Возможно, у животных разного пола КПН либо вовлекается в процессинг разных пептидов, в частности в ГГГС, либо различается доля ее участия в этом процессе.

Наибольшая активность ФМСФ-КП отмечена в гипофизе, надпочечниках и яичниках (рис. 6). В мозге распределение ФМСФ-КП хорошо коррелирует с интенсивностью обмена белка (наиболее высокая в больших полушариях), но не совпадает с распределением нейропептидов [38, 42, 43, 88, 103].

Обнаружено следующее соотношение активности ферментов в тканях интактных взрослых животных и в процессе их развития: КПН ≥ ФМСФ-КП в отделах мозга и гипофизе крыс обоего пола, а также семенниках взрослых животных. В надпочечниках животных обоего пола и яичниках активность ФМСФ-КП >> КПН.

Особенности тканевого и регионального распределния КПН и ФМСФ-КП и отличия их активности в одних и тех же отделах и тканях, вероятно, объясняются, также, некоторыми отличиями в их субстратной специфичности [40, 169, 174, 330].

Активность КПН и ФМСФ-КП у контрольных крыс изменяется с возрастом практически во всех отделах и тканях (рис. 1-8). Дисперсионный анализ показал достоверное влияние возраста во многих случаях (табл. 2, 3, 6, 7).

Согласно имеющимся литературным данным [12], в процессе пубертации наиболее существенные изменения отмечаются у самок крыс в инфантильном периоде (с Р8 по Р21), а у самцов – в ювенильном (с Р21 по Р32) и перипубертатном (после Р32) периодах. В отмеченные возрастные периоды происходит формирование важнейших органов и систем.

В этих же периодах была отмечена наибольшая активность исследованных нами ферментов. Так, у интактных самцов наибольшая активность КПН отмечалась Р120 в семенниках и в Р28 в остальных тканях (рис. 1, 2, табл. 2), у самок – в Р14 во всех тканях (рис. 3, 4, табл. 3). У интактных животных обоего пола наибольшая активность ФМСФ-КП отмечалась во всех тканях в Р14, а также в надпочечниках в Р0 и в яичниках в Р120 (рис. 5-8, табл. 6, 7).

Отличие полового созревания у самок и самцов в значительной степени обусловлено разным содержанием половых гормонов, регуляторных пептидов, в частности гипоталамических факторов, регулирующих половую функцию [12]. Этим можно объяснить результаты нашего исследования, показывающие различие в активности изучаемых ферментов (КПН и ФМСФ-КП) между интактными самками и самцами, как в мозге, так и в периферических тканях. Причем наибольшие (при достоверном влиянии пола) половые отличия активности КПН у интактных животных отмечены в гипофизе, надпочечниках, половых железах, ФМСФ-КП – в гипофизе и половых железах.

Результаты нашего эксперимента отметили сходство активности КПН и ФМСФ-КП в гипофизе, отделах мозга и их возрастной динамики в отделах мозга взрослых интактных животных. В надпочечниках и половых железах активность КПН отличалась от ФМСФ-КП. Возрастная динамика активности обоих ферментов в отделах мозга отличалась от периферических тканей и различалась между семенниками и яичниками. В надпочечниках и половых железах возрастная динамика активности КПН отличалась от ФМСФ-КП.

Согласно данным корреляционного анализа (табл. 13), в отделах мозга животных обоего пола разного возраста отмечена высокая положительная корреляция активности КПН и ФМСФ-КП. В гипофизе, надпочечниках и половых железах корреляции между ними нет.

Вероятно, все это объясняется тем, что КПН и ФМСФ-КП выполняют сходные функции в отделах мозга и разные – в периферических тканях:

• в отделах мозга у особей обоего пола (но особенно у самок) КПН и ФМСФ-КП примерно в одинаковой степени вовлекаются в процессинг пропептидов;

• в периферических тканях (яичниках и надпочечниках) ФМСФ-КП, в отличие от КПН, играет более существенную роль в процессинге регуляторных пептидов;

Табл. 13. Коэффициенты корреляции между активностью КПН и ФМСФ-КП в тканях самцов и самок в процессе индивидуального развития (достоверность корреляции * – р < 0,05; * * – р < 0,01; * * * – р < 0,001).

• в периферических тканях ФМСФ-КП также участвует в катаболизме белка.

• в процессинге гипофизарных пептидов у самцов участвует преимущественно КПН;

При влиянии пренатальной алкоголизации наблюдается нарушение возрастной динамики изменения активности КПН и ФМСФ-КП во многих тканях животных разного пола. Так, если у интактных животных пики уровней ферментативной активности совпадали с периодами формирования важнейших органов и систем [12], то у эмбрионально алкоголизированных такой зависимости, как правило, не наблюдалось. Причем значительные изменения активности ферментов обнаружены у животных обоего пола в Р0. Это, вероятно, связано с эффектом абстинентного синдрома, возникающего у самого новорожденного и у его матери, что также отражается на его состоянии [64, 130]. В последующих периодах такие значительные изменения ферментативной активности отмечались реже, возможно, из-за развивающихся компенсаторных метаболических механизмов [231]. В норме в процессе индивидуального развития организма отмечается изменение содержания различных биологически активных пептидов как в мозге, так и в периферических тканях [25, 52, 55, 76, 101, 118, 119, 158, 159, 162, 181, 247, 254, 266, 267, 275, 307, 310, 328, 342, 347, 349, 351]. При этом в разные возрастные периоды происходят существенные изменения соотношений между уровнями активных пептидов и их предшественников [266], или соотношений между уровнями пептидов, происходящих из одного предшественника [181, 310]. Что, по мнению авторов, свидетельствует об изменении специфичности процессинга предшественников в ходе индивидуального развития. Также высказывается мнение [353], что возрастные изменения уровней регуляторных пептидов связаны с изменениями в функционировани и ферментных систем, участвующих в их синтезе и деградации [129, 179, 180, 258, 259, 278, 326], в том числе и ФМСФ-КП [100]. Пренатальная алкоголизация проявляется в разных возрастных периодах в изменении уровней таких важных в патогенезе алкоголизма пептидов, как опиоидных пептидов в отделах мозга [69, 153, 263]. Имеются также разрозненные данные о нарушении содержания и функционирования других биологически активных веществ в разные возрастные периоды у пренатально алкоголизированных особей [6, 26, 64, 130, 265]. Очевидно, что изменение возрастной динамики активности КПН и ФМСФ-КП у эмбрионально алкоголизированных особей отражает один из механизмов опосредованного нарушения содержания активных пептидов во время важнейших пубертатных периодов и, следовательно, нарушение развития организма, отмечающегося у потомков алкоголиков [6, 26, 64, 130].

Характеристики

Список файлов ВКР