94599 (682172), страница 4

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

Исследование in vitro различных параметров ЛО с постоянной генерацией импульса позволил выявить оптимальную дозу, при которой зарегистрировано максимальное усиление функциональной активность НГ. Такими параметрами являются доза излучения 1,1 Дж/см², время экспозиции 12,5мин (20-кратное увеличение времени экспозиции от первоначального) (таблица2).

Анализ полученных результатов показал, что при импульсном режиме излучения доза, необходимая для максимальной активации клетки (0,056Дж\см²) ниже значений, позволяющей достичь аналогичного эффекта при ЛО с постоянной генерацией импульса (1,1Дж\см²). Тем не менее, изменения функциональной активности клеток имели одинаковую динамику, направленную в сторону усиления активности нейтрофила, независимо от режима следования импульса. Результаты наших исследований коррелируют с мнением И.И. Горяйнова (Горяйнов И.И.,1998), о том, что действие кванта света на разных режимах излучения имеет сходное биостимулирующее действие на клетку, т. е истинная природа фотоакцепторов квантов света оказывается не имеющей решающего значения, ибо их количество и многообразие вполне может уравнивать (усреднять) вторичные эффекты лазерных воздействий.

Наиболее значительные изменения зарегистрированы нами при анализе влияния НИЛИ с переменной и постоянной генерацией импульса на процессы внутриклеточной бактерицидности НГ. Можно предположить, что это данный процесс связан со стимуляцией лазерным излучением активности, локализованных в гранулах цитоплазмы НГ ферментов гексозомонофосфатного шунта, в частности НАДФ•H-оксидазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, отвечающей за редукцию НСТ (Маянский А.Н., 2006).

Для изучения правильности нашего предположения проведено измерение активности фермента НАДФ•Н-оксидазы, которой принадлежит ключевая роль в развитии респираторного взрыва, поскольку данный фермент осуществляет транспорт электронов от НАДФ цитозоля к молекулярному кислороду, а НИЛИ может являться физическим стимулятором выработки данного фермента (таблица 3).

Результаты исследований подтверждают наше предположение о том, что НИЛИ стимулирует выработку локализованных в гранулах цитоплазмы нейтрофилов фермента - НАДФ•Н оксидазы, поскольку нами зарегистрировано достоверное усиление выработки данного фермента более выраженное при облучении взвеси НГ с лазером с переменной генерацией импульса при дозе излучения 0,56 Дж/см²

Таблица 3

Влияние лазерного излучения с постоянной и переменной генерацией импульса на выработку НАДФН-оксидазы нейтрофилами, выделенными из крови доноров (М±m)

Доза лазерного излучения Дж\см2	Скорость НАДФН-оксидазной реакции пмоль/мин х106клеток
	Неактивированные нейтрофилы	Нейтрофилы, активированные ЛО с постоянной генерацией импульса	Нейтрофилы, активированные ЛО с переменной генерацией импульса
0,018	1.03±0.16	1.93±0.18 *,***	2.13±0.12 *,**
0,036	1.80±0.11	2.81±0.11 *,***	3.08±0.21 *,**
0,072	2.72±0.25	3.75±0.25 *,***	4.07±0.15 *,**
0,14	3.01±0.31	3.79±0.31 *,***	4.17±0.30 *,**
0,28	4.11±0.15	5.31±0.15 *,***	5.99±0.10 *,**
0,56	4.51±0.13	5.29±0.23 *,***	6.21±0.19 *,**
1,1	4.61±0.33	5.91±0.13 *,***	6.95±0.10 *,**

Примечание: *-достоверность различий показателей по отношению к неактивированным нейтрофилам, **-достоверность различий показателей по отношению к НГ, облучёнными с постоянной генерацией импульса, ***- достоверность различий показателей по отношению к НГ, облучёнными с переменной генерацией импульса С учетом поправки Бонферрони критический уровень р составил 0,003. U-критерий Мана- Уитни.

Для изучения секреторной функции нейтрофилов был проанализирован цитокиновый состав (таблица 4), содержание высокомолекулярных пептидов-дефенсинов и бактерицидного протеина BPI (таблица 5), биохимический состав супернатантов нейтрофилов (таблица 6). В результате проведённых исследований нами было выявлено, что нейтрофилы, полученные из периферической крови доноров и инкубированные в термостате в течение 30 мин. при температуре 37ºС в растворе Хенкса выделяют глюкозу, метаболиты азота, ионы кальция, магния, ИЛ-1α, ИЛ-1β, РАИЛ1, ИЛ-8, ФНО-α. Появление этих продуктов в супернатантах неактивированных нейтрофилов обусловлено, возможно, секреторной дегрануляцией клеток, происходящей при инкубации нейтрофилов не в физиологических условиях in vitro. Поэтому термин «неактивированные нейтрофилы» мы можем принимать лишь условно, как выделенные без индуктора секреции клеток, т.е. без лазерного излучения. Уровни изучаемых цитокинов в супернатантах неактивированных нейтрофилов доноров достоверно отличались от содержания в секреторных продуктах, выделенных после активации нейтрофилов лазерным излучением с постоянной и переменной генерацией импульса. Эти изменения имели однонаправленный характер, степень выраженности которых была различной.

Таблица 4

Содержание цитокинов в супернатантах нейтрофилов неактивированных и активированных лазерным излучением с постоянной и переменной генерацией импульса (М±m)

Цитокины	Супернатанты неактивированных нейтрофилов	Параметры излучения
		Супернатанты нейтрофилов активированные ЛО с постоянной генерацией импульса	Супернатанты нейтрофилов активированных ЛО с переменной генерацией импульса
ИЛ-1α, пг/мл	51.42±0.29	59.83±0.54 *, ***	62.43±4.41 *,**
ИЛ-1β, пг/мл	14.28±0.12	20.36±0.87 * ,***	24.47±12.21 *, **
РАИЛ-1,пг/мл	99.36±2.42	99.67±1.92	100.98±2.10 *
ИЛ-8, пг/мл	44.48±1.39	69.8±1.88 *, ***	136.8±21.71 *, **
ФНО -α, пг/мл	2.21±0.45	4.24±0.75 *, ***	6.31±0.33 *, **

Примечание: *-достоверность различий показателей по отношению к неактивированным нейтрофилам, **-достоверность различий показателей по отношению к НГ, облучённых лазером с постоянной генерацией импульса, ***- достоверность различий показателей по отношению к НГ, облучённых лазером с переменной генерацией импульса С учетом поправки Бонферрони критический уровень р составил 0,003. U-критерий Мана- Уитни.

Анализ цитокинового состава показал достоверно более высокое содержание провоспалительных цитокинов ИЛ-1α, ИЛ-1β, РАИЛ1, ИЛ-8, ФНО-α в супернатантах нейтрофилов крови доноров, облучённых лазером с переменной генерацией импульса (таблица 4). Возможно, данный вид излучений является стимулирующим фактором, приводящим к достоверно, по сравнению с неактивированными и активированными НИЛИ с постоянной генерацией импульса НГ доноров более выраженной секреции преформированных цитокинов. Помимо этого, в секреторных продуктах нейтрофилов были обнаружены высокомолекулярные пептиды, обладающие иммунотропной активностью-дефенсины и бактерицидный/индуцированный протеин BPI (таблица 5).

Таблица 5

Содержание дефенсинов и белка BPI в супернатантах нейтрофилов неактивированных и активированных лазерным излучением с постоянной и переменной генерацией импульса (М±m)

Примечание: *-достоверность различий показателей по отношению к неактивированным нейтрофилам, **-достоверность различий показателей по отношению к НГ, облучённых лазером с постоянной генерацией импульса, ***- достоверность различий показателей по отношению к НГ, облучённых лазером с переменной генерацией импульса С учетом поправки Бонферрони критический уровень р составил 0,003. U-критерий Мана- Уитни.

Результаты исследования биохимического состава секреторных продуктов неактивированных и стимулированных лазерным излучением нейтрофилов показали следующее (таблица 6). Продукты метаболизма оксида азота (NO) присутствовали как в супернатантах нейтрофилов интактных, так активированных ЛО НГ. Содержание метаболитов азота в супернатантах облучённых лазером нейтрофилов увеличилось в 3,7 раза по сравнению с содержанием продуктов метаболизма оксида азота с супернатантах интактных НГ. Более чем на 50% увеличилось содержание нитратов и нитритов в секреторных продуктах нейтрофилов, облучённых лазером низкой интенсивности.

Таблица 6

Биохимический состав в супернатантах нейтрофилов неактивированных и активированных лазерным излучением с постоянной и переменной генерацией импульса

Компоненты	Супернатанты неактивированных нейтрофилов	Параметры излучения
		Супернатанты нейтрофилов активированные ЛО с постоянной генерацией импульса	Супернатанты нейтрофилов активированных ЛО с переменной генерацией импульса
Нитраты, мкмоль/л	15.21±3.43	31.11±7,23 *, ***	39.19±7,26 *,**
Нитриты, мкмоль/л	43.1±5.17	82.38±22,83 *, ***	99.38±22.11 *,**
Общее содержание метаболитов оксида азота, мкмоль/л	28.31±8.35	137.91±35,24 *, ***	166.9±34.29 *,**
Са2+ моль/л	0.22±0.01	0.52±0.02 *, ***	0.70±0.04 *,**
Мg, 2+ моль/л	0.98±0.02	0.58±0,04 *, ***	0.48±0.03 *,**
Общее содержание глюкозы мкмоль/л	4.95±0,05	3.25±0.05 *, ***	2.01±0.02 *,**

Примечание: *-достоверность различий показателей по отношению к неактивированным нейтрофилам, **-достоверность различий показателей по отношению к НГ, облучённых лазером с постоянной генерацией импульса, ***- достоверность различий показателей по отношению к НГ, облучённых лазером с переменной генерацией импульса С учетом поправки Бонферрони критический уровень р составил 0,003. U-критерий Мана- Уитни.

Возможно, повышение содержания NO при воздействии НИЛИ происходит за счёт усиления окислительно-восстановительных процессов, в том числе ускорения реакции окисления аргинина ферментом NO-синтазой, результатом которой и является образование оксида азота (Артюхов В.Г., 2005). Выделяющийся в межклеточное пространство NO является реакционно-способным соединением с широким спектром биологического, в том числе, бактерицидного действия (Захарова М.А., 2003).

При изучении содержания глюкозы в супернатантах неактивированных и активированных нейтрофилов доноров было отмечено, что в ответ на стимуляцию гранулоцитов лазером низкой интенсивности уровень глюкозы достоверно снижается (р<0,003, р=0,00023) с 4,95 до 2,01 мкмоль/л, возможно, такой расход глюкозы, являющейся ключевым метаболитом биохимических процессов возможен вследствие повышения энергетических затрат клетки при её стимуляции лазерным излучением (Бережная Н.М., 1998; Маянский А.Н. и соавт., 1989).

Активация нейтрофилов лазером низкой интенсивности с постоянной генерацией импульса выявила рост уровня секреции ионов Са²⁺, в супернатантах нейтрофилов более чем в 3 раза по сравнению с неактивированными нейтрофилами доноров. Возможной причиной увеличения концентрации ионов Са^2+, после стимуляции НГ лазерным излучением является быстрый выход из органел- кальциосом в цитозоль большого количества ионов Са²⁺, в результате чего мы наблюдаем рост в супернатантах ионов кальция (Glossman H., 1999). Зарегистрированное снижение концентрации ионов Мg²⁺ возможно, происходят в результате его расходования на процессы активации процессов метаболизма, а именно катаболизма в клетке (Эллиот В., 2000). Сравнительный анализ биохимического, цитокинового состава супернатантов нейтрофилов облучённых лазерным излучением с постоянной и переменной генерацией импульса показал, что, несмотря на различный количественный состав секреторных продуктов, полученных в результате активации клетки лазерным излучением с постоянной и переменной генерацией импульса, данные изменения имели однонаправленный характер.

Характеристики

Список файлов реферата