94599 (682172), страница 3

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

Определение содержания цитокинов (ИЛ-1α, ИЛ-1β, РАИЛ1, ИЛ-8, ФНО-α, ИФН-γ), концентрацию IgА, IgМ, IgG, дефенсинов, белка ВРI сыворотки крови и в цервикальном секрете проводилось с использованием соответствующих тест-систем для иммуноферментного анализа (ООО «Цитокин» г. Санкт-Петербург; ООО «Стибиум», г. Санкт-Петербург; ООО «Вектор-Бест», г. Новосибирск; «Hycult biotechnology», Нидерланды). Концентрацию циркулирующих иммунных комплексов в периферической крови и цервикальном секрете устанавливали с помощью метода, предложенного В. Гашковой с соавт. (1978).Уровень общей гемолилитической активности комплемента (СН50) определяли методом титрования по 50% гемолизу. Содержание компонентов комплемента в сыворотке крови определяли методом молекулярного титрования (Красильников А.П.,1984). Содержание оксида азота и его метаболитов в сыворотке крови и цервикальном секрете определяли фотометрическим способом (Емченко Н.Л. с соавт., 1994 г.), в модификации Э.Н. Коробейниковой (2002 г). Исследование липидного спектра крови: общий холестерин (ОХС), холестерин липопротеинов низкой плотности (ХС ЛПНП), холестерин липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП), триглицериды (ТГ) проводилось ферментным способом на автоматическом биохимическом анализаторе «Cobas intesra 400 plus» (Швецария). Вычисление уровня ХС ЛПНП проводилось по формуле W. Freidwald (1972): ХС ЛПНП=ОХС-ТГ/2,2- ХС ЛПВП

Данные, обработанные методами вариационной статистики, выражали в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки. О достоверности различий средних величин судили с помощью непараметрических критериев: Манна-Уитни (U), Колмогорова-Смирнова (КS). Статистические процедуры, используемые для анализа качественных признаков, включали построение таблиц сопряженности и вычисление точного критерия Фишера (односторонний вариант) При проведении множественных сравнений использовали поправку Бонферрони (Гланц С., 2004; Сергиенко В.И., 2000). Результаты исследования обрабатывались на ПЭВМ с использованием пакета прикладных программ «Statistica for Windows», полученные данные выражали в Международной системе единиц (Липперт Г., 2002).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Этап исследования in vitro

Для решения поставленной цели, в экспериментальной модели было изучено влияние низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) на нейтрофилы, выделенные из периферической крови доноров, и их секреторные продукты. Выбор донорских нейтрофилов в качестве клеток мишеней ЛО (лазерного облучения) был обусловлен с одной стороны, их полифункциональной ролью в поддержании защитной реакции организма, а с другой, доступностью, и, в определённом смысле простотой исследования отдельных показателей их функциональной активности (Прозорова С.Г., 1998; Чичук Т.В.,1999; Юдина О.М., 2007). В соответствии с поставленной задачей, была исследована функциональная активность нейтрофилов донорской крови при действии на них, в условиях in vitro, различных доз лазерного излучения (ЛО), биохимический состав супернатантов интактных и облучённых лазером нейтрофилов.

Было изучено два режима низкоинтенсивного лазерного излучения (постоянная и переменная генерацию импульса). Для проведения экспериментальных исследований был использован лазерный излучатель «МУСТАНГ-2000» (НПЛЦ «Техника», г. Москва). В серии опытов, в аналогичных условиях выделенные из крови доноров нейтрофилы подвергали лазерному облучению суспензию, температура взвеси нейтрофилов составила 37⁰C. Для проведения ЛО нейтрофилов в силиконизированную кювету со светоизолированными стенками вносился 1 мл раствора Хенкса, содержащего 10⁵ нейтрофилов. Клетки облучали сверху при постоянной длине волны 0,63 мкм, поскольку по данным С.В Москвина (2004) длина волны 0,63 мкм соответствует на ионном уровне зоне адсорбции основных метаболитов НГ в световом спектре излучения лазера (Ben-Her E., 1993). Доза облучения взвеси нейтрофилов, рассчитанная с учётом частоты следования импульса от 20 до 2500Гц лежала в интервале значений 0,0018-1,1Дж\см². Время экспозиции 5-ти кратно увеличивалось-30 сек, 2,5 мин, 12,5 мин. Интактные нейтрофилы подвергали темновой инкубации при аналогичных условиях, но без ЛО.

Для исследования функциональной активности НГ интактных и облучённых лазером с постоянной и переменной генерацией импульса, биохимических особенностей супернатантов нейтрофилов были использованы иммунологические методы: определение лизосомальной фагоцитарной, активности нейтрофилов по НСТ-тесту, и биохимические методы - исследование активности НАДФ-оксидазы нейтрофилов, цитокинового профиля, содержания макроэлементов и глюкозы в супернатантах нейтрофилов.

Анализ дозозависимых эффектов действия ЛО с переменной генерацией импульса показал стимулирующее влияние излучений при длине волны 0,63 мкм, частоте 100 Гц, и дозой воздействия 0,56Дж\см². При данных параметрах нами отмечено максимальное усиление факторов кислородзависимой микробоцидной системы и фагоцитарной активности НГ. Лизосомальная активность нейтрофилов в ответ на стимуляцию лазером при повышении дозы излучения с от 0,0018 Дж\см² до 0,56Дж\см² снижалась; наблюдаемый процесс связан с тем, что активированные лазером нейтрофилы частично или полностью утрачивают свои гранулы, подвергаются дегрануляции или экзоцитозу, что не противоречит данным А.И. Козеля и Г.К. Попова по данной проблеме (Козель А.И., Попов Г.К., 2000) (таблица 1).

Поскольку наряду с ЛО при переменных воздействиях также используются излучения с постоянной генерацией импульса, следующей задачей исследования было изучение влияния дозы, времени экспозиции лазерного излучения с постоянной генерацией импульса на функциональную активность нейтрофилов донорской крови.

По мнению С.В.Москвина данный вид излучения обладает не менее высокой селективностью действия на биологические объекты, чем НИЛИ с переменной генерацией импульса (Москвин С.В., 2000). Условия выделения и дизайн проведения эксперимента были аналогичны модели, использованной нами при исследовании влияния излучения с переменной генерацией импульса.

Таблица 1.

Сравнительный анализ дозозависимого влияния НИЛИ с переменной генерацией импульса с частотой 100Гц, при длине волны 0,63 мкм, экспозиции 12,5 мин. на функциональную активность нейтрофилов периферической крови доноров (М±m)

Показатели	Дозы облучения в Дж/см2
	0,018	0,036	0,072	0,14	0,28	0,56	1,1
Показатель люминесценции лизосом, у.е	451.3±14.57*	294.3±12.51*,**	224.3±11.54*,**	224.6±11.59*,**	195.6±11.51*,**	156.6±11.52*,**	206.6±11.50*,**
Активность лизосом, %	95.21±1.25*	68.21±1.25*,**	44.21±1.12*,**	60.2±1.16*,**	49.2±1.12*,**	38.2±1.13*,**	78.2±1.12*,**
НСТ- спонтанная, %	43.88±1.59*	53.55±1.44*,**	61.1±1.41*,**	67.1±1.24*,**	72.1±1.34*,**	96.1±1.42*,**	30.1±1.41*,**
НСТ- спонтанная, у.е	0.48±0.05*	0.65±0.05*,**	0.78±0.02*,**	0.82±0.01*,**	0.88±0.01*,**	0.98±0.01*,**	0.50±0.01*,**
НСТ-индуцированная, %	67.86±1.45*	73.86±1.42*,**	74.86±1.32*,**	83.86±1.34*,**	93.86±1.31*,**	99.86±1.22*,**	43.86±1.23*,**
НСТ-индуцированная, у.е	0.79±0.03*	0.82±0.03*,**	0.75±0.02*,**	0.81±0.01*,**	0.88±0.01*,**	0.96±0.01*,**	0.52±0.01*,**
Функциональный резерв нейтрофилов	2.49±0.13*	1.30±0.13*,**	1.18±0.11*,**	1.15±0.11*,**	1.25±0.11*,**	1.1±0.12*,**	1.43±0.12*,**
Активность фагоцитоза,%	64.19±1.54*	75.19±1.53*,**	85.19±1.32*,**	89.19±1.21*,**	94.19±1.30*,**	98.19±1.31*,**	44.19±1.31*,**
Интенсивность фагоцитоза	2.16±0.11*	3.13±0.12*,**	3.62±0.11*,**	3.66±0.15*,**	3.81±0.10*,**	4.01±0.13*,**	1.62±0.14*,**

Примечание: *-достоверность различий показателей по отношению к неактивированным нейтрофилам, **-достоверность различий показателей разных групп, использован критерий Мана-Уитни

Таблица 2

Сравнительный анализ дозозависимого влияния НИЛИ с постоянной генерацией импульса при длине волны 0,63 мкм, экспозиции 12,5 мин. на функциональную активность нейтрофилов периферической крови доноров(М±m)

Показатели	Дозы облучения в Дж/см2
	0,018	0,036	0,072	0,14	0,28	0,56	1,1
Показатель люминесценции лизосом,у.е	300.19±12.12*	259.19±10.14*,**	249.19±12.22*,**	230.19±10.21*,**	229.19±11.16*,**	201.19±11.04*,**	181.19±13.02 *,**
Активность лизосом, %	90.08±1.02*	79.08±1.03*,**	72.08±1.01*,**	69.08±1.03*,**	63.05±1.03*,**	56.08±1.04*,**	48.05±1.03 *,**
НСТ- спонтанная, %	35.59±1.25*	42.59±1.22*,**	44.59±1.20*,**	54.59±1.22*,**	64.59±1.23*,**	88.59±1.19*,**	98.59±1.20 *,**
НСТ- спонтанная, у.е	0.39±0.01*	0.47±0.03*,**	0.58±0.03*,**	0.62±0.04*,**	0.69±0.03*,**	0.76±0.04*,**	0.89±0.01 *,**
НСТ-индуцированная, %	58.13±1.41*	69.13±1.44*,**	79.13±1.41*,**	82.13±1.42*,**	89.13±1.43*,**	95.13±1.44*,**	99.13±1.41 *,**
НСТ-индуцированная, у.е	0.67±0.03*	0.79±0.01*,**	0.88±0.02*,**	0.91±0.02*,**	0.94±0.03*,**	0.96±0.01*,**	0.98±0.03 *,**
Функциональный резерв нейтрофилов	2.27±0.11*	1.65±0.10*,**	1.79±0.11*,**	1.79±0.13*,**	1.41±0.12*,**	1.10±0.14*,**	1.02±0.11 *,**
Активность фагоцитоза,%	54.85±1.21*	66.85±1.20*,**	72.85±1.21*,**	80.85±1.23*,**	86.85±1.20*,**	95.85±1.24*,**	98.85±1.22 *,**
Интенсивность фагоцитоза	1.78±0.09*	2.1±0.09*,**	2.31±0.09*,**	2.51±0.09*,**	2.55±0.09*,**	2.65±0.09*,**	2.75±0.09 *,**

Примечание: *-достоверность различий показателей по отношению к неактивированным нейтрофилам, **-достоверность различий показателей разных групп, использован критерий Мана-Уитни

Характеристики

Список файлов реферата