94599 (682172), страница 2
Текст из файла (страница 2)
ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИСЕРТАЦИИ.
Диссертация изложена на 354 страницах машинописного текста, содержит 71 таблицу и 12 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 5 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Библиография включает в себя 395 литературных источников, в том числе 270 отечественных и 125 зарубежных
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальный этап исследования
В соответствии с задачами были исследованы функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов (НГ) донорской крови при действии на них, в условиях in vitro, лазерного излучения с различными дозами. Для получения нейтрофилов использовали 15,0 мл гепаринизированной (10-15 ЕД/мл гепарина фирмы «Гедеон- Рихтер», Hungery) периферической крови, которую с целью осаждения эритроцитов отстаивали в стерильной пробирке с добавлением 10% раствора желатина в соотношении 10:1 при температуре + 37 ºС в течение минут. Нейтрофилы выделяли из лейкоцитарной взвеси в двойном градиенте плотности стерильных растворов фиколла-верографина (Parmacia, Sweden, Spofa, CSSR). Плотность верхнего слоя градиента составляла 1.075-1.077, а нижнего 1.093-1.095 (Wong L., 1975). Объём каждого градиента равнялся 1,5 мл. Количество нейтрофилов доводили до концентрации 5 х10 6 клеток\мл.
Было изучено два вида низкоинтенсивного лазерного излучения (постоянная и переменная генерацию импульса). При облучении нейтрофилов использовали лазерный излучатель «Мустанг-2000». Воздействие на нейтрофилы проводили в кювете со светопоглощающими стенками таким образом, чтобы мощность лазерного излучения, на уровне дна кюветы, измеренная с помощью дозиметра («Анод», Россия), соответствовала выбранным дозам. Доза облучения, рассчитанная с учётом частоты следования импульса от 20 до 2500Гц, мощности излучения, диаметра светового пятна лежала в интервале значений 0,0018-1,1 Дж\см2. Используемые режимы чаще всего применяются в экспериментальной и клинической практике (Александрова О.Ю., 2003). Для проведения эксперимента нейтрофилы облучали при постоянной длине волны 0,63 мкм. Световое поле для облучения взвеси НГ конфигурировали таким образом, чтобы в любой точке зоны облучения значение отклонения плотности светового потока было не более чем на 10%, что обеспечивало практически одинаковые условия для равномерного облучения суспензии НГ. Равномерность распределения светового потока производили при помощи люксметра («Mastech» модель M S6610) в отн. ед (Люкс). Для исследования влияния ЛО с переменной генерацией импульса были выбраны следующие частоты: 20 Гц, 100 Гц, 500 Гц, 2500 Гц, которые подбирали таким образом, чтобы обеспечить равные дозовые нагрузки при всех режимах воздействия при проведении эксперимента.
Функциональную активность интактных и облучённых лазером низкой интенсивности нейтрофилов определяли по способности клеток к поглощению частиц латекса, лизосомальной активности (Фрейдлин И.С., 1984), показателям НСТ-теста (Маянский А.Н., Виксман М.Е., 1979).
Выделение секреторных продуктов полиморфноядерных лейкоцитов, выделенных из крови здоровых доноров и стимулированных лазерным излучением низкой интенсивности, проводили с помощью метода, разработанного И.И. Долгушиным и А.В. Зурочкой (Долгушин И.И., Зурочка А.В., 1992).
С целью подробного исследования продуктов секреции интактных и облучённых нейтрофилов мы определяли их биохимический и цитокиновый состав. При изучении биохимического состава продуктов секреции полиморфноядерных лейкоцитов мы исследовали содержание глюкозы, макроэлементов (Са2+, Мg2+), продуктов метаболизма оксида азота, содержания НАДФ-оксидазы в нейтрофилах. Количественное определение глюкозы осуществляли с помощью набора «Глюкоза-ФКД» на биохимическом анализаторе Roki (Ольвекс диагностикум, Санкт-Петербург). Содержание кальция и магния в супернатантах нейтрофилов проводили унифицированным калориметрическим методом на биохимическом анализаторе Roki (Ольвекс диагностикум, Санкт-Петербург). Определение оксида азота, нитратов, нитритов в супернатантах нейтрофилов, проводилось фотометрическим способом (Емченко Н.Л. с соавт., 1994 г.), в модификации Э.Н. Коробейниковой (2002 г). Определение активности фермента НАДФН-оксидазы в нейтрофилах было исследовано спектрофотометрическим способом на спектрофотометре Shimadzu (Япония).
При оценке цитокинового состава супернатантов нейтрофилов определяли наличие в них следующих провоспалительных цитокинов: ИЛ-1α, ИЛ-1β, РАИЛ 1, ИЛ-8, ФНО-α. С этой целью использовали соответствующие тест-системы ООО «Цитокин»(г. Санкт-Петербург), основанные на "сендвич-методе" твёрдофазного ИФА с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента (Кетлинский С.А., Калинина К.М., 1998). Определение дефенсинов, бактерицидного белка BPI в сыворотке супернатантах интактных и активированных НИЛИ нейтрофилов определяли с помощью набора реактивов «HNP1-3» (HyCult biotechnology», Нидерланды) с использованием метода основанного на двухсайтовом твёрдофазном ИФА.
Исследование влияния лазерного излучения на функции нейтрофилов и факторы мукозального иммунитета репродуктивного тракта in vivo
За период с 2005 по 2008 год нами проведено открытое, краткосрочное, простое, "слепое" рандомизированное исследование влияния лазеротерапии на состояние клеточных и гуморальных факторов местной и системной противоинфекционной защиты у 80 здоровых и 386 женщин с заболеваниями нижнего отдела репродуктивного тракта, находившимся на обследовании и лечении в Государственном лечебно-профилактическом учреждении здравоохранения «Челябинский областной кожно-венерологический диспансер», консультативно-диагностическом центре ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия». План исследования соответствовал положениям Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации (ВМА) последнего пересмотра (г. Эдинбург, Шотландия, 2000 г.), с учётом разъясняющего примечания п.29, одобренного Генеральной ассамблеей ВМА (Вашингтон, 2002) и был одобрен этическим комитетом ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».
Возраст 80 здоровых женщин составил 26,5±0,95, средний возраст инфицированных женщин -27,2 ±2,08 лет. 386 женщин с монохламидийной и хламидийно-микоплазменной инфекцией нижнего отдела репродуктивного тракта сопоставимые по возрасту, гинекологическому анамнезу, отсутствию соматической патологии, однонаправленным изменениям системного и локального иммунного статуса были разделены согласно принципу адаптивной рандомизации следующим образом: Первую группу больных составили 100 женщин с хламидийной инфекцией нижнего отдела репродуктивного тракта. Обнаружение ДНК возбудителей выполнялась с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием диагностических тест-систем ООО «Литех», г. Москва. Диагноз ставился врачом-дерматовенерологом в соответствии с международной статистической классификацией болезней МКБ-10 (2000). Всем женщинам с хламидийной инфекцией нижнего отдела репродуктивного тракта поводилась базисная терапия согласно методическим рекомендациям по диагностике и лечению наиболее распространенных инфекций, передаваемых половым путём («Методические материалы по диагностике и лечению наиболее распространенных инфекций, передаваемых половым путём; протоколы ведения больных» ГУ ЦНИКВИ МЗ РФ; Москва; 2008). Схема лечения включала антибактериальную, десенсебилизирующую терапию, протеолитические ферменты, местно антисептики.
Пациенткам второй группы, состоящей из 100 женщин, наряду с базисной была местно применена лазеротерапия с использованием аппарата «МУСТАНГ-2000» (режим постоянной генерации импульса). Длина волны излучения 0,632 мкм, постоянный режим генерации импульса, время облучения 10 минут. Курс лечения составил 10 ежедневных процедур
В третью группу вошли 106 женщин, которым в комплексе с базисной терапией были предложены локальные физиотерапевтические процедуры с применением НИЛИ с переменной генерацией импульса аппаратом «МУСТАНГ - 2000» . Аппарат имеет Сертификат соответствия Госстандарта России, выданной Органом по сертификации ИМН ВНИИИМТ и соответствует ГОСТ Р50444-92, ГОСТ Р50267.0-92(МЭК 601-1-88), ГОСТ Р500267.0.2-95(МЭК601-1-2-93), ГОСТ Р50723-07. Сеансы лазерного излучения проводились в амбулаторных условиях, в специально оборудованном кабинете согласно «Санитарным нормам и правилам устройства и эксплуатации лазеров» № 5804-91. Положение больной при проведении локальной лазеротерапии - лёжа в гинекологическом кресле или на кушетке на спине, ноги согнуты в тазобедренных суставах и разведены (Александрова О.Ю., 2003). Процедура локальной лазеротерапии проводилась при помощи специальной разовой насадки, которая рассеивала исходящее из терминала аппарата лазерное излучение во все стороны. Длина волны излучения 0,632 мкм, переменный режим генерации импульса время облучения 10 минут.
Курс лечения составил 10 процедур и занимал один межменструальный промежуток. Лечение с применением низкоинтенсивного лазерного излучения осуществлялось согласно методическим рекомендациям УГМАДО г. Челябинска (2000г.), использование лазеротерапии при лечении хламидийной инфекции нижнего отдела репродуктивного тракта рекомендовано МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского (2000г.). Методики использования лазеротерапии сертифицированы Роспотребнадзором и предложены к включению в комплекс лечебных мероприятий при лечении инфекционно- воспалительных заболеваниях урогенитального тракта, вызванных ИППП; ГОСТ Р50444-04, ГОСТ Р50267.0-04(МЭК 601-1-88), ГОСТ Р500267.0.2-95(МЭК601-1-2-04), ГОСТ Р60725-04 выданной Органом по сертификации ИМН ВНИИИМТ.
В отдельную группу вошли 80 женщин, которым наряду с базисным лечением, было проведено внутрисосудистое лазерное облучение крови (ВЛОК) аппаратом «МУЛАТ». Положение больной при проведении лазеротерапии - лёжа на кушетке, на спине. Процедура лазеротерапии проводилась при помощи одноразовых стерильных световодов с иглой (КИВЛ-01(ОС-2), путем венопункции в локтевую или подключичную вену вводят иглу тонким стерильным световодом ОС-2 (НПЛЦ «Техника», г. Москва), через который происходит облучение протекающей крови. Длина волны излучения 0,632 мкм, мощность излучения 1мВт, постоянный режим генерации импульса время облучения 40 минут. Курс лечения составил 7 ежедневных процедур (Руководство по использованию аппарата «МУЛАТ», 2008).
Все исследования проводились на основании информированного добровольного письменного согласия обследуемых. Критерии включения: наличие хламидийной инфекции нижнего отдела репродуктивного тракта женщин. Критерии исключения: наличие тяжёлой соматической патологии (ИБС, стенокардии, гипертонической болезни, острых и обострение хронических заболеваний, онкозаболеваний, аутоиммунной патологии), гормональных нарушений, беременности, лактации, наличии сопутствующих венерических заболеваний, ВИЧ инфекции, других инфекций, передающихся половым путём, включая папилломавирусную, герпетическую, цитомегаловирусную инфекции, несогласие пациенток на участие в исследовании.
Комплексное обследование больных с хламидийной инфекцией нижнего отдела репродуктивного тракта включало сбор анамнеза, осмотр, комплекс инструментальных методов исследования, включающих ультразвуковое исследование половых органов осуществлялось на ультразвуковом сканере Aloka SSD-680, цитологическое исследование мазков с экзо- и эндоцервикса; биопсию шейки матки с последующим гистологическим исследованием полученного материала (Прилепская В.Н., Кондриков Н.И. и соавт., 2000), кольпоскопию с оценкой состояния слизистой оболочки нижней трети цервикального канала,
Бактериологическое исследование на наличие гонококков и трихомонад, проводилось согласно методическим рекомендациям МЗ РФ «О совершенствовании контроля за заболеваниями, передающимися половым путем» (Приказ МЗ РФ № 286 от 07.12.93 г.). Культуральной диагностике предшествовало бактериоскопическое исследование материала из заднего свода влагалища и цервикального канала. Микроскопии подвергались окрашенные по Граму и метиленовым синим мазки. Определение грибов рода Candida проходило с использованием среды Сабуро и 5 % кровяного агара. Диагностическим повышенным титром грибов рода Candida была концентрация 103 КОЕ / мл и выше.
Оценка локального и системного иммунного статуса, была проведена до начала лечения и на его заключительном этапе. Материалом для исследования служили периферическая кровь и цервикальный секрет.
При иммунологическом обследовании в периферической крови определяли общее количество лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, содержание лимфоцитов, несущих рецепторы CD3, CD4, CD8, CD16, CD25, CD34, CD95, CD HLA-DR у здоровых и женщин с хламидийной инфекцией нижнего отдела репродуктивного тракта по методике имунофенотипирования в модификации С.В. Сибиряка и соавт.(1997) с использованием моноклональных антител серии ИКО: анти- CD3, анти- CD4, анти- CD8, анти- CD16, анти- CD25, анти- CD34, анти- CD95,анти- CD HLA-DR («Медбиоспектр», Москва). Функциональную активность нейтрофилов слизи и периферической крови изучали по способности клеток к поглощению частиц латекса, лизосомальной активности (Фрейдлин И.С., 1984), показателям НСТ-теста (Маянский А.Н., Виксман М.Е., 1979).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
