92837 (680962), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Обсяг і структура дисертації. Робота викладена на 115 сторінках тексту і складається із вступу, огляду літератури, 4 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків і практичних рекомендацій. Роботу ілюстровано 22 таблицями, 4 рисунками. Перелік використаних джерел налічує 263 найменування, що займає додатково до основного тексту 26 сторінок.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Об’єкт та методи дослідження. Згідно з поставленими задачами дисертаційна робота складалась з експериментальних та клінічних досліджень.
Експериментальна частина роботи здійснювалась в лабораторії медичної біохімії Інституту біохімії ім. О.В. Паладіна НАН України. Досліди проводили на невагітних і вагітних самицях щурів лінії Wistar із середньою масою 120,0±5,0 г та новонароджених тваринах, які утримувались на дієті віварію, а також при додатковому введенні вітаміну D3.
Враховуючи, що при хронічній нирковій недостатності зменшується маса функціонально діючих нефронів, експериментальну модель цієї патології викликали прийнятим методом, шляхом односторонньої нефректомії. Проведена серія експериментів дозволила досліджувати обмін речовин при тривалій нирковій недостатності в динаміці у вагітних щуриць, їх плодів та новонароджених щурят. Гостру ниркову недостатність викликали перев’язуванням у тварин сечоводів.
У ході клінічних досліджень було проведено комплексні клінічні та лабораторні обстеження 103 жінок на 38-40 тижнях вагітності та їх новонароджених в 1-й тиждень життя. Серед них у 81 жінки вагітність перебігала на тлі хронічного пієлонефриту. Новонароджені діти від цих матерів склали основну групу спостереження. 22 жінки з фізіологічним перебігом вагітності були здорові і їх новонароджені діти склали групу контролю.
В ході виконання роботи були застосовані наступні біохімічні методи дослідження. Вміст кальцію в сироватці крові визначали за допомогою тест-набору виробництва ЛАХЕМА (Чехія). Кількість фосфору визначали шляхом фотометрії при 670 нм і розраховували в ммолях на 1 л сироватки крові. Активність загальної лужної фосфатази та її ізоферментів визначали за допомогою біотест-наборів виробництва ЛАХЕМА (Чехія). Визначення плацентарної лужної фосфатази проводили шляхом використання в якості інгібітора цього ізоферменту лужної фосфатази 2-фенілаланінамід у концентрації 5,4 ммоль. Вміст активних метаболітів вітаміну D3 визначали після екстракції 0,5 мл сироватки крові диетиловим ефіром у співвідношенні до об’єму сироватки крові 1:16 протягом 10 хв. Повторну екстракцію проводили 95% етанолом у співвідношенні 1:2. Суміш розчинників упарювали до зникнення запаху розчинників. Первинний хроматографічний розподіл метаболітів вітаміну D3 проводили методом колоночної хроматографії. В якості носія використовували окис алюмінію. Хроматографічний розподіл проводили по схемі: 25 мл 70% гексану у хлороформі (виділяли вітамін D3); 20 мл 15% етанолу у хлороформі (сума активних метаболітів вітаміну D3). Останню фракцію упарювали і проводили повторну процедуру колоночного хроматографічного розподілу. В якості носія використовували сефадекс LH-20. Фракції активних метаболітів упарювали і визначали вміст 25ОНD3, 1,25(ОН)2D3 та 24,25(ОН)2D3 методом радіоконкурентного зв’язування. В якості зв’язуючи системи для 25ОНD3 та 24,25(ОН)2D3 використовували сироватку крові щурів, яких протягом 30 діб витримували на D-гіповітамінозній дієті і для 1,25(ОН)2D3 – цитозольний білок тканини слизової оболонки тонкого кишечнику одномісячних кролів. Сироватку крові та цитозольний білок зберігали у запаяних ампулах при температурі -20єС. Немічені 25ОНD3, 24,25(ОН)2D3, 1,25(ОН)2D3 (Hoffman-La Roche, Швейцарія) розчиняли в абсолютному етиловому спирті. Калібрувальні графіки будували при кожному визначені активних метаболітів вітаміну D3 Коефіцієнт повернення, який ураховували при розрахунку їх вмісту, визначали шляхом введення у сироватку крові мічених метаболітів вітаміну D3, які піддавали обробці згідно описаному для їх визначення. Вміст паратгормону у сироватці крові визначали методом радіоімунологічного аналізу із використанням стандартних наборів фірми «Сорін», Італія. Для визначення вмісту глюкози, сечовини, запальних ліпідів також використовували біо-тест-набори виробництва ЛАХЕМА (Чехія). Визначення вмісту холестеролу в сироватці крові проводили реакцією ЕМА. Аналіз сумарних фосфоліпідів в сироватці крові проводили після їх екстракції сумішшю хлородіорм: метанол (2:1). Отриманий ліпідний екстракт з додаванням хлорної кислоти випалювали на піщаній бані протягом 2 годин при 200єС. Після випалювання загальний вміст фосфоліпідів визначали по концентрації ліпідного фосфору [Дусе] і розраховували в ммолях на 1 л сироватки крові. Білок у сироватці крові визначали методом Лоурі. Усі процедури з тваринами проводили під легким ефірним наркозом.
Всім новонародженим дітям крім клінічного та лабораторного обстеження на 4-5 добу життя було проведено ехографію нирок та комплексне ультразвукове дослідження кардіальної, церебральної і ниркової гемодинаміки за допомогою ультразвукових апаратів “Aloka SSD-2000“ (Японія); SONOACE-9900“ (“Medison“, Корея) конвексними і лінійними трансдюсерами з частотою 3,5-5 МГц за стандартною методикою з індивідуальним визначенням фокусу, динамічного діапазону і підсилення. Обстеження 54 новонароджених проводилось двічі до лікування та після курсу лікування, при цьому 23 дитини отримували удосконалений лікувальний комплекс, а 32 – загальноприйнятий.
Обробку цифрових даних проводили математичними методами, вибір яких визначався завданням у кожному конкретному випадку. Обчислення виконувались на комп’ютері типу Intel PIII з використанням прикладного пакету програм “Statistica 6.0”.
Результати особистих досліджень та їх обговорення. Шляхом експериментальних досліджень проведених у тварин з гострою нирковою недостатністю отримано дані, які свідчать про те, що при гострій нирковій недостатності в організмі розвиваються значні порушення мінерального обміну (зниження в сироватці крові вмісту загального кальцію, підвищення концентрації неорганічного фосфору та збільшення активності лужної фосфатази) з одночасним порушенням обміну вітаміну D в нирках та у печінці. Це підтверджується зниженням в сироватці крові не тільки концентрації диоксівітамінів D3 – 24,25(ОН)2D3 та 1,25(ОН)2D3, які синтезуються в нирках, але й вмісту 25-ОНD3, котрий утворюється з вітаміну D3 в печінці і становить основну транспортну форму цього вітаміну, за концентрацією якої в крові оцінюють D-вітамінну забезпеченість організму.
Під час вагітності на тлі хронічної ниркової недостатності, внаслідок односторонньої нефректомії, у щуриць і у плодів встановлено наявність гіповітамінозу D, при цьому вміст транспортної форми вітаміну D3 (25ОНD3) у плода нижчий, ніж у матері, а у новонародженого він нижчий за рівень його у плода. В подальшому на 14 добу життя вміст 25ОНD3 вітаміну D в сироватці крові новонароджених підвищується, але не досягає показників у контрольних щурят (народжених псевдооперованими самицями щурів) (рис.1).
Наявність D-вітамінної недостатності у вагітних щуриць з односторонньою нефректомією супроводжувалась порушенням кальцій-фосфорного обміну в їх організмі та організмі плода і новонародженого (рис.2). При цьому рівень кальцію та неорганічного фосфору в сироватці крові у них значно нижче, ніж у контрольних тварин, особливо наприкінці вагітності, і хоча плід "гіперкальціємічний" відносно організму матері, як це спостерігається і при фізіологічній вагітності, все ж таки він значно нижче забезпечений солями кальцію та фосфору у порівнянні з плодом у псевдооперованих тварин. Отримані дані свідчать також про те, що при експериментальній нирковій недостатності у щуриць, новонароджені щурята мають набагато нижчі показники вмісту кальцію та неорганічного фосфору в сироватці крові у порівнянні з контрольними щурятами і хоча в подальшому вміст цих макроелементів в крові підвищується, все ж на 14 добу він не досягає показників у новонароджених від псевдооперованих щуриць.
Проведеними дослідженнями встановлено, що за умов експериментальної ниркової недостатності відмічається зниження забезпеченості самиці, плода та новонародженого гормонально-активними метаболітами вітаміну D3, але характер цих змін різний. Якщо вміст в крові 24,25(ОН)2D3 при односторонній нефректомії у вагітних щуриць, їх плодів та новонароджених значно нижчий за показники у контрольних тварин, то вміст 1,25(ОН)2D3 у контрольній групі тварин характеризувався підвищенням його у самиць наприкінці вагітності, зниженням у плода і новонародженого та збільшенням на 14 добу життя щурят. За умов односторонньої нефректомії низькі показники цього метаболіту в сироватці крові виявлені як наприкінці вагітності, так у плода і новонароджених щурят протягом 14 днів життя, що може бути обумовлено, з одного боку, зменшенням синтезу цього метаболіту в організмі вагітної щуриці внаслідок зниження загальної маси нефронів при односторонній нефректомії, з другого – зниженням його синтезу плацентою, зумовленого її функціональною недостатністю при цій патології.
Виявлені в системі мати-плацента-плід-новонароджений зміни в забезпеченості вітаміном D3, його гормонально-активними метаболітами та дефіцит кальцію і неорганічного фосфору в організмі плода і новонародженого при експериментальній нирковій недостатності, за нашими даними, супроводжувались підвищенням вмісту паратгормону наприкінці вагітності у плода та новонародженого відносно цих показників в контрольній групі псевдооперованих щуриць та їх плодів і щурят.
Враховуючи результати проведеного нами експерименту, які підкреслюють важливу фізіологічну роль кальцію та вітаміну D в організмі, їх участь в процесах становлення всіх життєвоважливих функцій, остеогенезу, диференціації клітин в тканинах різних органів і систем, можна вважати, що порушення ранньої неонатальної адаптації, функціональні розлади та підвищена захворюваність немовлят, які народились у жінок з запальними ураженнями нирок та сечовидільної системи значною мірою пов'язані з дефіцитом та порушенням обміну вітаміну D і кальцію в системі мати-плацента-плід.
Доказом цього є отримані нами експериментальні дані про те, що введення вагітним самицям протягом усього періоду вагітності 10 або 20 МО вітаміну D3 сприяло дозозалежному підвищенню у новонароджених вмісту в крові транспортної форми вітаміну D3 на 60-70% та збільшенню концентрації кальцію і неорганічного фосфору на 47-66% і 27 та 68%, відповідно. Через місяць після народження вміст цих показників в обох групах щурят був майже однаковий, але значно вищий у порівнянні з показниками щурят, матері-щуриці котрих не отримували вітаміну D3 додатково до стандартної дієти віваріуму.
Введення вітаміну D3 щурицям під час вагітності сприяло також покращанню обміну речовин у новонароджених щурят за показниками вмісту в їх крові холестеролу, загальних ліпідів, білку, глюкози та сечовини у порівнянні з такими у щурят, матері яких не отримували додатково вітаміну D3 протягом вагітності (таблиця 1). Одночасно спостерігалось підвищення активності мікросомальної та мітохондріальної гідроксилаз у гепатоцитах новонароджених, а також активності цих ферментів на 10 та 20 доби життя у порівнянні з такими у щурят, матері яких не отримували вітамін D, що було показано нами у щурят в дослідах in vitro. При цьому інтенсивність збільшення активності мітохондріального ферменту в гепатоцитах новонароджених з часом була меншою, ніж мікросомальної гідроксилази, що свідчило про більшу функціональну зрілість печінки у новонароджених щурят від самок, які отримували вітамін D і здатність її більш активно утворювати із вітаміну D його транспортну форму, яка є субстратом для синтезу гормонально-активних метаболітів вітаміну D у нирках.
Таким чином, в результаті виконаних експериментальних досліджень доведено, що при хронічній нирковій недостатності в системі мати-плацента-плід-новонароджений мають місце значні зміни обміну вітаміну D та кальцію і фосфору, які призводять до дефіциту вітаміну D у вагітної, плода і новонародженого, розвитку у них гіпокальціємії, гіпофосфатемії та підвищення активності лужної фосфатази і вмісту паратгормону в крові. При цьому за показниками вмісту холестеролу, загальних ліпідів, загального білку, глюкози та сечовини у сироватці крові у новонароджених має місце функціональна незрілість багатьох органів у систем, що негативним чином відбивається на стані обміну речовин. Додаткове введення вітаміну D3 протягом вагітності сприяє покращанню D-вітамінного обміну та зменшенню дефіциту кальцію в організмі новонароджених, сприяє покращанню функціонального стану печінки за показниками мікросомальних та мітохондріальних гідроксилаз, що в свою чергу оптимізує умови для нормального перебігу процесів обміну речовин в організмі.
Клінічні дослідження показали, що особливістю перебігу вагітності у матерів з хронічним пієлонефритом була висока частота таких ускладнень, як ранні гестози, прееклампсія, фето-плацентарна недостатність, анемія, загроза переривання вагітності. У ј жінок цієї групи під час вагітності відмічалась одно-дворазове загострення хронічного пієлонефриту. Найбільш частими ускладненнями пологів були ранній вилив навколоплодових вод та слабкість родової діяльності. Шляхом кесарського розтину народились 22,2% дітей, у контрольній групі в тричі менше (6,7%). Передчасні пологи мали місце у 27,2% жінок основної групи.
Треба зазначити, що всі вагітні жінки з хронічним пієлонефритом протягом ІІІ триместру вагітності спостерігались у відділенні патології вагітності ДУ “ІПАГ АМН України“ і отримували профілактично-лікувальний комплекс, до складу якого входив препарат "Прегнавіт" (по 2 капсули на добу). Здорові вагітні контрольної групи одержували Прегнавіт по 1 капсулі на добу в якій міститься 200 МО вітаміну D3.
При хронічному пієлонефриті у матерів, діти народжувались з більш низькою масою тіла, зумовленою затримкою внутрішньоутробного розвитку. Для них була характерна непропорційність антропометричних даних: при нормальних розмірах голови спостерігалась певна гіпотрофія тулуба, у таких новонароджених відмічались потоншений шар м'яких тканин, сухість шкіри, прояви недостатньої мінералізації кісток та розходження основних кісткових швів черепа, збільшені розміри великого тім'ячка, м'якість при пальпації грудної клітки. Ознаки асфіксії помірного ступеня при народженні мали 70,4% дітей від матерів з хронічним пієлонефритом і лише у 18,2% дітей, матері яких були практично здорові.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
