9963 (646188), страница 4

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

Дослiдження, проведенi на пацюках i мишах, показали, що три-

вале введення малих доз окису тритiю (180 дiб) приводить до стiй-

кого спустошення стволового кровотворного пула, яке зберiгасться

до кiнця життя. Незворотне скорочення кiлькостi полiпотентних по-

передникiв Т-клiтин вiдмiчалося i пiсля тривалого зовнiшнього -

-опромiнення. Спостерiгалися значнi порушення Т-лiмфопоезу, не

вiдновлювалися популяцii зрiлих, функцiонально-активних лiмфоци-

тiв. Iмунодефiцитний стан формувався в результатi стiйкоi гiпопла-

зii лiмфоiдноi тканини. Причому гiпоплазiя тимусу та лiмфатичних

вiддiлiв виражена сильнiше, нiж у селезiнцi i кiстковому моз-

ку [

2. МАТЕРIАЛИ I МЕТОДИ ДОСЛIДЖЕННЯ.

2.1 ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСТЕЖЕНИХ ГРУП.

Обстеження проводилися на практично здорових волонтерах,

що навчаються в Черкаському державному унiверситетi на фа-

культетах фiзвиховання та природничому факультетi.

Показники клiтинного iмунiтету у практично здорових во-

лонтерiв студентiв факультету фiзичного виховання та студен-

тiв природничого факультету розглядалися як контрольнi

дослiдження. Для проведення iмунологiчних обстежень на кож-

ного волонтера заповнюсться карта iндивiдуального обстежен-

ня, розроблена в Республiканському центрi iмунологiчних дос-

лiджень.

В контрольну групу вiдбиралися волонтери-чоловiки, що

вiдповiдали слiдуючим критерiям:

-вiсутнiсть професiйних шкiдливостей;

-вiдсутнiсть побутових шкiдливостей (контакт з нiтрофарбами,

гербiцидами, пестицидами);

-вiдсутнiсть перенесених iнфекцiйних захворювань, травм,

опiкiв;

-вiдсутнiсть в анемнезi: хiмiкотерапii (цитостатиками, гор-

мональними препаратами, iмунодепресантами i iмуностимулято-

рами) та променевоi терапii;

-iмунологiчно не обтяжений сiмейний анемнез;

-вiдсутнiсть клiнiчних ознак iмунологiчноi недостачi;

-вiдсутнiсть хронiчних захворювань.

Карта iндивiдуального iмунологiчного обстеження запов-

нювалась в двух екземплярах: один направлявся в Республiкан-

ський центр iмунологii, другий залишався на кафедрi фiзiо-

логii iз подальшим занотуванням на комп'ютерi IВМ РС/ХТ 286

в iмунологiчнiй лабораторii.

До дослiдних груп належали студенти факультету фiзично-

го виховання та студенти природничого факультету, котрi заз-

нали дii малих доз iонiзуючоi радiацii, проживаючи у зонiпо-

ситленого радiацiйного контролю (4-та зона).

До проведення iмунологiчного обстеження на пiддос-

лiдних заповнювалися карти iндивiдуального iмунологiчного

обстеження.

Для проведення дослiдiв по змiнi показникiв клiтинного

iмунiтету в периферичнiй кровi обстеженню пiдлягали слiдуючi

групи:

1-ша група - практично здоровi волонтери, що навчаються на

4-му курсi факультету фiзвиховання ЧДУ;

2-га група - практично здоровi волонтери, щонавчаються на

4-му курсi природничого факультету ЧДУ;

3-тя група - особи, що проживають в зонi посиленого

радiацiйного контролю та навчаються на 4-му

курсi факультету фiзвиховання ЧДУ;

4-та група - особи, що проживають в зонi посиленого

радiацiйного контролю та навчаються на 4-му

курсi природничого факультету ЧДУ;

2.2 МЕТОДИКА ВИЗНАЧЕННЯ СУБПОПУЛЯЦIЙ Т-ЛIМФОЦИТIВ

У ВЕНОЗНIЙ КРОВI З ВИКОРИСТАННЯМ МОНОКЛОНАЛЬНИХ

СИВОРОТОК

Специфiчнi антитiла зв'язуються з мембранними антигена-

ми живих клiтин, що знаходяться у суспензii. Щоб запобiгти

келiнгу i iндингу (злущуванню) антигенiв пiсля взасмодii з

антитiлами, до суспензii клiтин добавляють 0.2%-й азид нат-

рiю. У прямих методах IФА використовують специфiчнi до

клiтинних антигенiв антитiла, коньюгуючi з флуорисцентною

мiткою. А маркування клiтин проводять як одноетапну реакцiю.

У непрямих методах IФА в якостi антитiл використовують

не мiченi антитiла до клiтинних антигенiв, а в якостi дру-

гих - мiченi флуорохромом антитiла до iмуноглобулiнiв. Мар-

кування клiтин проводять у два етапи.

Другi антитiла служать для виявлення зв'язаних з клiти-

ною перших антитiл.

Непрямi методи, як правило, чутливiшi прямих.

1. Венозну кров (7 мл) з антикоагулянтом (9.8% цитрат нат-

рiю 0.5 мл, або 25 од/мл гепарина) розбавлясмо фосфатним

буфером у спiввiдношеннi 1:1.

Склад фосфатного буферу:

КН РО 1,15 г.

Na HPO 0,2 г.

КСl 0,2 г.

NaCl 8 г.

на 1мл. дистильованоi води

До фосфатного буферу додасмо 2 г. сироватки альбумiнiв

кролика.

2. На свiжоприготовлений одноступеневий фiкол-верографiно-

вий градiснт (2 мл.) нашаровусмо за допомогою пiпетки з

грушею розбавлену ФБ (фосфатним буфером) кров у центри-

фужнiй пробiрцi.

Методика виготовлення фiкол-верографiна.

24,4 г. фiколу-400 розчиняють у теплiй дистильованiй

водi. Змiшують з 49,9 мл. 70% розчину верографiну. До-

водять об'см до 340 мл. Температура зберiгання розчину

+8 С.

3. Пробiрки з градiснтом кровi центрифугусмо протягом

20-25 хв.

4. Вiдбирасмо пiпеткою з грушею середнiй опалесцуючий

шар,що мiстить лiмфоцити у окремi пробiрки.

5. Вiдмивасмо популяцiю лiмфоциту вiд залишкiв градiснта

фосфатним буфером двiчi, за допомогою центрифугування

протягом 10 хв. Декантусмо. Вiдмивку повторюсмо 2 рази.

6. Доводимо концентрацiю мононуклеарних клiтин за допомо-

гою розведення ФБ до рiвня 1-5 х 10 кл./мл.

Контроль концентраццii проводимо вкамерi Горясва (в од-

ному великому квадратi повинно мiститись 20 лiмфатич-

них клiтин).

7. До 50 мкл одержаних клiтин добавлясмо мiкропiпеткою по

5 мкл. антисироватки LT3 - для визначення кiлькостi

зрiлих Т-клiтин у венознiй кровi (CD3), LT1 - для

зрiлих i майже зрiлих Т-лiмфоцитiв (CD5), LT4 - для

визначення Т-хелперiв (CD4), LT8 - для визначення

Т-супресорiв (CD8).

8. Iнкубусмо сумiш лiмфоцитiв з антисиворотками протягом

20-25 хв при кiмнатнiй температурi.

9. Вiдмивасмо мононуклеари вiд залишкiв не зв'язаноi АС.

Для цього у кожну пробiрку доливасмо по 2 мл ФБ з кро-

лячим альбумiном (2.5%) i центрифугусмо протягом 10

хв. Вiдмивку повторюсмо двiчi. 10. До 50 мкл отриманоi

сумiшi добавляемо по 5 мкл ФIТЦ. Iнкубусмо 20-25 хв.

11. Проводимо вiдмивку вiд флуоресцуючих антитiл мононук-

леари. Вiдмивку проводимо аналогiчно вiдмивцi вiд анти-

сивороток тричi. 12. Мононуклеари за допомогою пiпетки

наносимо на предметне скельце. 13. Скельця помiщасмо на

пiдставки у чашки Петрi з розчином формалiну i фiксус-

мо препарат у його парах на протязi 10 хв. 14. Зафiксо-

ваний препарат пiдсушують при кiмнатнiй темпера -

турi.Готовi препарати зберiгаються у холодильнiй камерi

протягом 3-х дiб. 15. Аналiз препаратiв. Пiдрахунок

проводиться шляхом перерахунку % флуоресцуючих клiтин

на 100 клiтин проглянутих у препаратi. Мiкроскопують за

допомогою мiкроскопу з люмiнiсцентною насадкою,

окуляр-7, об'сктив-90. У якостi iмерсii використовус-

ться водний розчин глiцерину.

2.3. МЕТОДИКА ПIДРАХУНКУ ЧИСЛА ЛЕЙКОЦИТIВ В КРОВI

1. Палець протерти ватою змоченою 70% розчином спитту.

2. Одноразовим стерильним скарифiкатором проколоти

палець.

3. Першу краплю кровi зтерти ватою змоченою спиртом.

4. Декiлька крапель кровi з пальця витиснути на пред-

метне скло.

5. Капiляром Салi 0,02 мл. кровi перенести в центри-

фужну пробiрку з 0,4мл. 3% розчину оцтовоi кислоти.

6. Легким посту куванням по пробiрцi перемiшати вмiст

i залишити пробiрку для руйнування еритроцитiв.

7. Притерти покривне скло до камери Горясва таким чи-

ном, щоб з'явилися Ньютоновi кiльця.

8. Пiдрахувати кiлькiсть клiтин в 25 великих квадра-

тах камери Горясва.

9. Одержаний результат перерахувати за формулою:

Х 10/20, де Х - кiлькiсть клiтин в 25 великих

квадратах.

Нормальна кiлькiсть лейкоцитiв у дорослоi людини коливас-

ться в межах 4500-10000 в 1 куб.мм.

2.4 МЕТОДИКА ВИЗНАЧЕННЯ ДИФЕНРЕНЦIЙОВАНОI ФОРМУЛИ

ЛЕЙКОЦИТIВ.

Визначення загальноi кiлькостi бiлих кров'яних тiлець,

дас уяву проiх абсолютну кiлькiсть. Але не дас вiдомостей

про процентне спiввiдношення (диференцiйовану формулу) мiж

рiзними видами лейкоцитiв i про якiснi змiни в iх морфологii

при хворобливих станах.

Визначення диференцiйованоi формули проводиться на фар-

бованому мазку кровi.

Диференцiйована формула характерно змiнгюсться при рядi

хворобливих станiв i мас надзвичайно важливе дiагностичне i

прогностичне значення.

Нормальна диференцiйована формула дорослоi людини нас-

тупна:

молодi нейтрофiльнi клiжтини - 0%

паличкоядернi нейтрофiльнi клiтини - 0-4%

сегментоядернi нейтрофiльнi клiтини - 55-70%

лiмфоцити - 20-40%

моноцити - 2-6%

еозинофiльнi клiтини - 1-4%

базофiльнi клiтини - 0-1%

плазматичнi клiтини - 0-5%

ВИГОТОВЛЕННЯ МАЗКА КРОВI.

1.Необхiдною умовою для правильного пiдрахунку морфо-

логiчних особивостей кров'яних клiтин являсться вда-

лозроблений i добре забарвлений кров'яний мазок.

Добре зроблений мазок кровi повинен вiдповiдати наступ-

ним умовам:

а) починасться на 1 см. вiд вузького краю предметного

скла i закiнчусться на 2-3 см. вiд його другого краю.

Загальна довжина мазка повинна охоплювати 1/2 - 3/4

скла.

б) мазок повине бути рiвномiрноi товщини, а не хвили-

подiбний. Правельний мазок кровi товщий на початку, поступо-

во тоншас i закiнчусться у виглядi слiду, мов би залишеного

тонкою щiточкою.

в) мазок повинен бути вiдокремленим вiд краю.

Шар кровi не повинен доходити до другогоь краю скла.

Приготування мазкiв проводиться слiдуючим чином: пред-

метне скло, на якому буде зроблено мазок, беруть за один

кiнець великим i вказiвним пальцями правоi руки. Другий

кiнець, вiдступаючи на 1 см. вiд краю, обережно дотикасться

до свiжоiкраплi капiлярноi кровiiз пальця, нi в якому разi

не торкаючись шкiри в мiсцi проколу. Крапля кровi перехо-

дить на скло, вона повинна мати дiаметр 2-3 мм.

Предметне скло перекладають у лiву руку взявши його ве-

ликим вказiвним i середнiм пальцямитак, щоб крапля знаходил

ась зверху на предметному склi, з боку вказiвного i серед-

нього пальцiв.

Шлiфоване скло, яким буде зроблено мазок вставлясться

пiд кутом 40-45 на 1-2 мм перд краплею, придержуючи великим

i вказiвним пальцями правоi руки край шлiфованого скла i

обидва краi предметного скла. Шлiфоване скло рухають назад

так, щоб воно торкалося кровi i крапля поширювалася в кутi

мiж шлiфованим i предметним склом. потiм швидким рухом ру-

хаючи скло в зв оротньому напрямку роблять мазок.

Протягом того часу коли робиться мазок, великий iвказiвний

пальцi правоi руки ковзають по краях предметного скла i тим

створюють необхiдну опору для накладання шару кровi.

ФАРБУВАННЯ КРОВ'ЯНОГО МАЗКА.

Для якiсного дослiдження морфологii кров'яних клiтин-

фарбування кров'яного мазка мас важливе значення. Основу су-

часного фарбування кров'яних клiтин поклав петербуржський

лiкар Д.Л.Романовсьий. В 1891 роцi вiн запропонував свiй

барвник. В 1902 роцi Гiмза вдосконалив барвник Романовського.

Барвник Романовського-Гiмза складасться з лужноi i кис-

лоi частини. Лужна частина - азур 2, А кисла частина - еозин.

Азур 2 забарвлений в яскраво-синiй колiр, а еозин в роже-

во-червоний.

Щоб приготувати основний розчин барвника розчиняють 30

г. азуру 2-еозину i 0,8г. азуру 2 в 250 мл. глiцерину, наг-

рiваючи прицьому 90-120 хв. при 50 С, а потiм додають 250мл.

чистого метилового спирту. Пiсля вiдстоювання протягом 1-7

днiв при кiмнатнiй температурi фiльтрують.

ФIКСАЦIЯ КРОВ'ЯНОГО МАЗКА.

Перед фарбуванням мазок кровi фiльтрують. Це робиться

для денатурацii бiлкiв у клiтинах, при збереженнi iхжиттсвоi

структури iж для закрiплення клiтин на предметному склi. Для

фiксацii використовусться абсолютний метиловий алкоголь. Час

фiксацii - 3-5 хв.

Перед роботою ,пiсля фiксацii, препарат заливають робо-

чим розчином (розведеним) барвника Романовського-Гiмза. I

залишають на 20-40 хв. Потiм його промивають, сушать, див-

ляться пiд мiкроскопом.

ПIДРАХУНОК ДИФЕРЕНЦIЙОВАНОI ФОРМУЛИ.

Кров'янi клiтини не розподiляються рiвномiрно повсьому

препратi.На початку i в кiнцi мазка вiдкладасться бiльшiсть

великих клiтин з малою питомою вагою (моноцити,

гранулоцити), а в серединi - бiльшiсть малих клiтин, з вели-

кою питомою вагою (лiмфоцити). Порiвняно найбiльш правильне

спiввiдношення складасться на дiлянках показаних на малюнку:

Характеристики

Список файлов реферата