115359 (617502), страница 7

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 7)

Процесс получения лизина основан на стереоспецефическом ферментативном гидролизе (конверсии) D-, L-α-амино-ε-капрлактама, который сначала получают химическим путём из циклогексена. Рацемат используют в качестве субстрата, который под действием лактамазы превращается в L-лизин, а непрореагировавшая D-форма переводится в смесь антиподов рацемазой. Лактамаза найдена у некоторых дрожжей (Candida laurentil). Рацемаза обнаружена у ряда бактерий (Alkaligenes obae).

Получение триптофана

Химико-ферментативный способ получения триптофана состоит в прямой конденсации индола, аммиака и ПВК. Реакцию катализирует пиридоксальзависимая триптофаназа. Фермент найден у E.coli.

Получение L-яблочной кислоты.

Яблочная кислота – заменитель лимонной в продуктах питания и лекарственных препаратах. Яблочную кислоту получают, используя иммобилизованные в полиакриламидном геле клетки, содержащие фумаратгидратазу. В присутствии этого фермента происходит присоединение воды по двойной связи в молекуле фумаровой кислоты.

HOOC-CH=CH-COOH+H₂O = HOOC-CH(OH) – CH₂-COOH

Перспективы технологии иммобилизованных ферментов[4]

Сегодня в промышленности реализовано всего четыре крупномасштабные технологии на основе иммобилизованных ферментов (глюкоизомеразы, аминоацилазы, пенициллазы и лактазы). В обозримом будущем иммобилизованные ферменты могут быть использованы для следующих целей.

1. Холинэстераза может применяться для определения пестицидов. Степень ингибирования этого фермента в присутствии пестицидов оценивают электрохимическими или колориметрическими методами.

2. Иммобилизованная диизопропилфторфосфатаза нервных клеток кальмара может найти применение для обезвреживания фосфорорганических нервных газов.

3. Иммобилизованная гепариназа может применяться для предотвращения тромбообразования в аппаратах искусственного кровообращения.

4. Предложен новый способ применения иммобилизованного гемоглобина. Включённый в полиуретановую матрицу белок образует «гемогубку», способную поглощать кислород прямо из воды с эффективностью 80%. Далее кислород высвобождается из полимера под действием слабого электрического разряда. Предполагается, что такая система может снабжать кислородом водолазов либо работающие под водой двигатели.

5. Возможно, вскоре удастся создать системы из нескольких иммобилизованных ферментов. Так, если заключить в микрокапсулы уреазу, глутаматдегидрогеназу и глюкозодегидрогеназу, то их можно будет использовать для удаления мочевины из крови больных с почечной недостаточностью.

6. Разнообразные иммобилизованные ферменты находят применение в датчиках быстрого анализа.

7. В последнее время большое внимание уделяется использованию различных микробных оксигеназных систем в стереоспецефическом эпоксиокислении олефинов.

1.5 Основы получения метаболитов

Процессами биотрансформации называют реакции превращения исходных органических соединений (предшественников) в целевой продукт с помощью клеток живых организмов или ферментов, выделенных из них.

По отношению к процессу роста низкомолекулярные продукты метаболизма живых клеток делятся на первичные и вторичные метаболиты. Первичные метаболиты необходимы для роста клеток. К ним относятся структурные единицы биополимеров – аминокислоты, нуклеотиды, моносахариды, а также витамины, коферменты, органические кислоты и другие соединения. Вторичные метаболиты (антибиотики, пигменты, токсины) – низкомолекулярные соединения, не требующиеся для выживания клеток и образующиеся по завершении фазы их роста.

Механизмы интенсификации процессов получения продуктов клеточного метаболизма

В норме обмен веществ в клетке осуществляется по принципам строжайшей экономии, что обеспечивается сложнейшей системой регуляции обмена веществ. Задача биотехнолога состоит в обеспечении сверхсинтеза одного из продуктов метаболизма, что достигается как путем изменения генетической программы организма, так и посредством нарушения регуляторных систем метаболизма в нем[7].

Для выделения из природных популяций высокопродуктивных штаммов микроорганизмов используют методы селекции, т.е. направленного отбора организмов со скачкообразным изменением геномов. Для возникновения мутаций интересующий ген должен удвоиться 10⁶-10⁸ раз. Более эффективен метод искусственного повреждения генома. Таким методом является индуцированный мутагенез, основанный на использовании мутагенного действия ряда химических соединений, рентгеновских и ультрафиолетовых лучей.

Координация химических превращений, обеспечивающая экономность метаболизма, осуществляется у микроорганизмов тремя основными механизмами: регуляцией активности ферментов, в том числе путем ретроингибирования; регуляцией объема синтеза ферментов (индукция и репрессия биосинтеза ферментов); катаболитной репрессией.

В процессе ретроингибирования (ингибирование по принципу обратной связи) активность фермента, стоящего в начале многоступенчатого превращения субстрата, тормозится конечным метаболитом, что детально разработано при изучении регуляции биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов и новообразования ряда аминокислот.

На обмен веществ, аналогичный конечным метаболитам, оказывают эффект их аналоги. Для отбора объектов продуценты выращивают на селективной среде, содержащей подходящий аналог или антиметаболит, которые не включаются в обмен веществ (в частности, аналоги аминокислот не включаются в состав белков), что ведет к подавлению роста организма. Выжившие мутанты обладают дефектами в механизме регуляции активности фермента по принципу обратной связи и поэтому служат важными объектами в обеспечении сверхсинтеза целевого продукта.

Так, мутации по участкам цистрона, детерминирующим структуру аллостерического центра фермента, могут привести к изменениям в конформации белка, которые делают молекулу энзима нечувствительной к концентрации конечного продукта. Это обеспечивает возможность образования в клетке избыточного количества целевого продукта.

Мутации в гене-регуляторе проводят таким образом, чтобы его продукт – белок-репрессор – утрачивал способность связываться либо с индуктором, либо с оператором. В результате мутаций индуцибельные ферменты становятся конститутивными. Мутантные организмы, у которых изменены нуклеотидные последовательности в зоне гена-оператора, не могут связывать нормальный репрессор и также приобретают способность к конститутивной экспрессии структурных генов. Мутанты с дефектами регуляторной области оперона называются регуляторными. Из-за отсутствия или выключения фермента, катализирующего промежуточную стадию процесса, в среде накапливается не конечный продукт, а промежуточный целевой метаболит. Мутанты с ограниченной способностью к образованию конечных продуктов называются ауксотрофными.

Биотехнология получения первичных метаболитов

Производство аминокислот

Среди соединений, получаемых биотехнологическими методами, аминокислоты занимают первое место по объему производства и второе место по стоимости, уступая по последнему параметру лишь антибиотикам. Объем мирового производства аминокислот составляет более 500 тыс. т в год, из которых 300 тыс. т приходится на глутамат натрия, 100 тыс. т на лизин и 140 тыс. т на метионин.

В промышленных масштабах белковые аминокислоты получают:

1) гидролизом природного белоксодержащего сырья;

2) химическим синтезом;

3) микробиологическим синтезом;

4) биотрансформацией предшественников аминокислот с помощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов (химико-микробиологический метод).

В ходе кислотного гидролиза белков происходят рацемизация и разрушение некоторых составляющих их аминокислот. При кислотном гидролизе полностью разрушается триптофан и достаточно значительны потери цистеина, метионина и тирозина (10–30%).

Существенный недостаток методов химического синтеза аминокислот состоит в получении целевых препаратов в виде рацемической смеси D- и L-стереоизомерных форм. Подавляющее большинство природных аминокислот относится к L-ряду. Исключением в этом отношении является лишь метионин, метаболизм которого нестереоизбирателен, благодаря чему данная аминокислота получается преимущественно путем химического синтеза.

Наиболее перспективен и экономически выгоден микробиологический синтез аминокислот. Более 60% всех производимых в настоящее время промышленностью высокоочищенных препаратов белковых аминокислот получают именно этим способом, главное преимущество которого в сравнении с методами химического синтеза состоит в возможности получения L-аминокислот на основе возобновляемого сырья.

Промышленное производство аминокислот стало возможным после открытия способности у некоторых микроорганизмов выделять в культуральную среду значительные количества какой-либо одной аминокислоты (С. Киносита, 1955). При этом было подмечено, что большинство из нескольких тысяч проанализированных диких штаммов микроорганизмов продуцировали аминокислоты во внешнюю среду, но в очень незначительных количествах. И лишь один из обследованных микроорганизмов – Corynebacterium glutamicum был способен к сверхсинтезу глутамата. Этот штамм использовали при организации первого в мире крупномасштабного производства глутаминовой кислоты микробиологическим способом в Токио (1956). Распространенные объекты селекции продуцентов – микроорганизмы, относящиеся к родам Brevibacterium, Microcjccus, Corynebacterium, Arthrobacter.

Производство лизина. В клетках микроорганизмов лизин синтезируется из аспарагиновой кислоты и служит конечным продуктом разветвленного метаболического пути биосинтеза, общего для трех аминокислот – лизина, метионина и треонина.

Эффекта накопления в среде всего одной целевой аминокислоты добиваются путем блокирования процессов, ведущих к синтезу побочных аминокислот, возникающих в связи с разветвлением метаболического пути. У типичных продуцентов L-лизина – Brevibacterium flavum и Corynebacterium glutamicum – фермент аспартаткиназа, открывающий метаболический путь, является аллостерическим белком, чувствительным к ингибированию по принципу обратной связи при совместном действии побочных продуктов L-треонина и L-лизина.

Чтобы добиться образования лизина в больших количествах, получают мутанты двух типов. У мутантов первого типа не синтезируется или не функционирует гомосериндегидрогеназа, в результате чего блокируется синтез метионина и треонина. Мутанты второго типа дефектны по структурному гену, детерминирующему конформацию аспартаткиназы. В итоге фермент теряет чувствительность к высоким концентрациям аллостерического ингибитора – лизина.

Производство триптофана. Подобно лизину триптофан образуется в ходе разветвленного метаболического пути, поэтому для его производства используют ауксотрофных мутантов, у которых блокированы реакции, ведущие к синтезу фенилаланина и тирозина. Однако при выращивании мутантных штаммов в среде с минимальной концентрацией этих аминокислот, не вызывающей регуляторных эффектов, избыточное накопление триптофана в среде не наблюдается, что объясняется особенностью процессов регуляции биосинтеза триптофана у микроорганизмов.

Триптофан оказывает ингибирующее действие на антранилатсинтетазу, поэтому для обхода метаболического контроля синтез фермента индуцируют ступенчатым введением предшественника – антраниловой кислоты:

В связи с этой особенностью промышленное производство триптофана организовано преимущественно по двухступенчатой схеме. На первом этапе химическим способом синтезируют антраниловую кислоту, которую с помощью энзиматической системы мутантных штаммов дрожжей Candida utilis переводят в триптофан.

Кроме триптофана микробиологическим способом с использованием предшественников получают гистидин, изолейцин, метионин, серин и треонин.

Для получения аминокислот – конечных продуктов неразветвленных метаболических путей, например аргинина, ауксотрофные мутанты не используют. В этом случае применяют мутанты с дефектами регуляции биосинтеза аминокислоты, т.е. регуляторные мутанты.

Производство витаминов

Благодаря изучению физиологии и генетики микроорганизмов – продуцентов витаминов и выяснению путей биосинтеза каждого из них создана теоретическая основа для получения микробиологическим способом практически всех известных в настоящее время витаминов. Однако с помощью энзимов целесообразнее производить лишь особо сложные по строению витамины: В₂, В₁₂, β-каротин (провитамин А) и предшественники витамина D. Остальные витамины либо выделяют из природных источников, либо синтезируют химическим путем.

Получение витамина В₂ (рибофлавин). Вплоть до 30-х годов прошлого столетия рибофлавин выделяли из природного сырья. В наибольшей концентрации он присутствует в моркови и печени трески. Из 1 т моркови можно изолировать лишь 1 г рибофлавина, а из 1 т печени – 6 г. В 1935 г. обнаружен активный продуцент рибофлавина – гриб Eremothecium ashbyii, способный при выращивании на 1 т питательной смеси синтезировать 25 кг витамина В₂. Сверхсинтеза рибофлавина добиваются действием на дикие штаммы мутагенов, нарушающих механизм ретроингибирования синтеза витамина В₂, флавиновыми нуклеотидами. Отбор мутантов ведут по устойчивости к аналогу витамина В₂ – розеофлавину.

Характеристики

Список файлов курсовой работы