115359 (617502), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Начиная с 1970 г. стали появляться серьезные работы по изучению генов азотфиксации и их переносу в клетки Klebsiella pneumoniae и E.coli. Конструирование плазмид, несущих nif-гены, позволяет передавать способность к фиксации азота организмам, не обладающим этим свойством. Среди бактерий, кроме E.coli, такой перенос осуществлен для бактерий Salmonella typhimurium, Erwinia herbicola и других. Однако подобные манипуляции могут приводить к нежелательным эффектам. Так перенос генов в штамм Erwinia (бактерии, вызывающие гниение растений) может усилить его патогенное действие.
В настоящее время внимание ученых привлекают проблемы введения генов азотфиксации в клетки растений; создания ризоценозов между небобовыми растениями (особенно злаками) и азотфиксирующими организмами. Наиболее интересна первая проблема – введение nif-генов в клетки растений. Однако её решение сопряжено с рядом трудностей. Основная – разрушение нитрогеназы под воздействием кислорода. У азотфиксирующих микроорганизмов существует ряд приспособлений, защищающих бактерии от свободного кислорода. Таким образом, введение только nif-генов в какую-то растительную клетку не решает проблемы. Кроме того, сама клетка, в которую переносят гены азотфиксации, может быть не приспособлена к синтезу и расходованию большого количества энергии, которое требуется для фиксации азота. Следовательно, более перспективно повышение эффективности фиксации азота в уже существующих природных системах за счет воздействия на гены, контролирующие этот процесс, а также увеличение мощности корневой системы бобовых растений и создание новых азотфиксирующих систем с помощью методов клеточной инженерии.
Наибольший урон растениям приносят грибные, бактериальные и вирусные патогенны. В растении существуют защитные механизмы, которые в большей или меньшей степени (в зависимости от устойчивости растений) начинают действовать в ответ на проникновение фитопатогенов в клетку. Во-первых, начинается синтез соединений, вызывающих гибель патогенов. Примером могут служить специфические белки PRP (pathogen related proteins). Из них наиболее изучены ферменты хитиназы и β-1,3 – глюконазы, которые угнетают рост грибов и некоторых видов бактерий, разрушая их клеточные стенки. Во-вторых, могут создаваться структурные барьеры, препятствующие распространению инфекции. Это достигается благодаря лигнификации клеточных стенок.
Так, гены хитиназы и глюконазы кодируются одиночными генами. Благодаря этому были получены трансгенные растения табака и турнепса, в состав генома которых ввели ген хитиназы. Лабораторные и полевые испытания выявили большую устойчивость трансгенных растений. В растения томатов был введен ген защитных пептидов редьки (дефензинов) rs, отвечающих за устойчивость к фитопатогенным грибам.
Другой подход к получению трансгенных растений, устойчивых к вирусной инфекции, состоит во введении в геном исходных растений гена оболочки вируса. Это приводит к ингибированию размножения вируса и снижению инфицированности. Благодаря такому подходу был получен стойкий антивирусный эффект у растений табака, трансформированных геном оболочки вируса табачной мозаики (ВТМ).
Создание трансгенных растений, устойчивых к насекомым, с помощью методов генной инженерии стало возможным после того, как было обнаружено, что бактерии Bacillus thurengiensis синтезируют специфический белок – прототоксин, высокотоксичный для насекомых. Попадая в кишечник насекомого, этот белок расщепляется, образуя активную форму токсина. В результате насекомое погибает. Ген, ответственный за экспрессию прототоксина, удалось обнаружить, выделить из генома B. thurengiensis и с помощью бинарного вектора ввести в геном растений табака.
Аналогичным образом растения томата были трансформированы генами другого инсектицидного белка – эндотоксина. В итоге были получены первые трансгенные растения, которые не повреждали насекомые (рис. 9).
Исследователи Колорадского университета (США) выяснили, что повреждению растений при замерзании способствуют бактерии эпифитной (поверхностной) микрофлоры Pseudomonas syringae и Erwinia herbicola, белки которых служат центрами кристаллизации[19]. Если обезвредить бактерии стрептомицином, то растения не замерзают при температуре -8ºС. Но стрептомицин дорог и вреден, поэтому выгоднее было изменить генетику данного штамма бактерий, вырезав из генома определенный ген. Растения, инфицированные мутантным штаммом P. syringae, росли при отрицательной температуре. Однако оказалось, что бактерии мутантного штамма более живучи и способны вытеснить природный штамм, который, попадая в верхние слои атмосферы, способствует кристаллизации атмосферной влаги. Вероятно, уничтожение природного штамма могло бы привести к экологической катастрофе.
Нельзя не сказать о «неопределённом» влиянии ГМ – продуктов на животные объекты. Всё же отмечены факты: у крыс, которых в течении девяти месяцев кормили ГМ – картофелем, произошло стойкое нарушение иммунной системы и ЖКТ.
Божьи коровки, которые питались тлями, жившими на ГМ – картофеле, становились бесплодными и т.д. Некоторые авторы связывают данные явления с «горизонтальными» потоками генетической информации[19].
Генную терапию на современном этапе можно определить как лечение наследственных, мультифакторных и ненаследственных (инфекционных) заболеваний путем введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций[2]. Первые клинические испытания методов генной терапии были предприняты 22 мая 1989 года с целью генетического маркирования опухоль-инфильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирующей меланомы. Первым моногенным наследственным заболеванием, в отношении которого были применены методы генной терапии, оказался наследственный иммунодефицит, обусловленный мутацией в гене аденозиндезаминазы (ADA). 14 сентября 1990 года в Бетесде (США) четырехлетней девочке, страдающей этим достаточно редким заболеванием (1: 100 000), были пересажены её собственные лимфоциты, предварительно трансформированные вне организма (ex vivo) геном ADA (ген ADA + ген neo + ретровирусный вектор). Лечебный эффект наблюдался в течение нескольких месяцев, после чего процедура была повторена с интервалом 3–5 месяцев. В результате лечения состояние пациентки настолько улучшилось, что она смогла вести нормальный образ жизни и не бояться случайных инфекций.
В 1997 году число допущенных к клиническим испытаниям протоколов составляло уже 175, более 2000 пациентов приняли участие в их реализации.
До настоящего времени интеграция в геном достигалась только при использовании ретровирусных либо аденоассоциированных векторов. В последнее время особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих (Mammalian Artificial Chromosomes). Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы.
Современный уровень знаний не позволяет проводить коррекцию генных дефектов на уровне половых клеток и клеток ранних доимплантационных зародышей человека в связи с реальной опасностью засорения генофонда нежелательными искусственными генными конструкциями или внесением мутаций с непредсказуемыми последствиями для будущего человечества.
1.2 Биотехнологические процессы в пищевой промышленности
Молочные продукты
В пищевой промышленности для получения молочных продуктов применяют, главным образом, ферментацию[4]. В сквашивании молока обычно принимают участие стрептококки и молочнокислые бактерии; лактоза при этом превращается в молочную кислоту. Путем использования иных реакций, которые сопутствуют главному процессу или идут при последующей обработке, получают и другие продукты переработки молока. Среди них пахта, сметана, йогурт и сыр.
В молоке при ферментации могут протекать шесть основных реакций, и в результате образуются молочная (СН3СН(ОН) СООН), пропионовая (СН3СН2СООН) или лимонная кислота ((НООССН2)2С(ОН) СООН), спирт (С2Н5ОН), масляная кислота (С3Н7СООН) или же происходит колиформное газообразование. Главная из этих реакций – образование молочной кислоты. На ней основаны все способы ферментации (сквашивания) молока. Лактоза молока гидролизуется при этом с образованием галактозы и глюкозы. Обычно галактоза превращается в глюкозу ещё до сквашивания. Имеющиеся в молоке бактерии преобразуют глюкозу в молочную кислоту (путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса). Образование сгустка казеина происходит в изоэлектрической точке этого белка (рН 4,6) под действием молочной кислоты. Этот процесс лежит в основе сыроварения.
При производстве швейцарского сыра ключевую роль играет маслянокислое брожение с образованием углекислого газа.
С6Н12О6=СН3СН2СН2СООН+2СО2+2Н2
Именно это обуславливает своеобразный вкус (букет) этих сыров и образование глазков. Характерный вкус пахты, сметаны и сливочного масла формируется в результате лимоннокислого брожения. Он складывается из составляющих вкусов диацетила (СН3С(О) С(О) СН3), пропионовой и уксусной кислот и близких к ним соединений. Различные процессы ферментации молока проводят сегодня в контролируемых условиях. В течение многих прошедших тысячелетий они осуществлялись при участии бактерий, исходно присутствующих в молоке. В наше время для этого используют разнообразные закваски, позволяющие получать молочные продукты нужного качества и типа. Применяющиеся при этом культуры живых бактерий могут представлять либо один какой-то штамм определенного вида, либо несколько штаммов и / или видов.
Хотя свойства сыров чрезвычайно разнообразны, в процессе выработки всех их есть много общего. Первый этап – это подготовка культуры молочнокислых бактерий и засев ею молока. Затем молоко створаживают, для чего обычно применяют фермент реннин. После отделения водянистой жидкости (сыворотки) полученную творожистую массу подвергают термообработке и прессуют в формах. Далее сгусток солят и ставят на созревание. На следующем этапе сыры отправляют на созревание или выдержку. Созревание происходит в специальных помещениях с контролируемой температурой и длится до четырех лет. Микроорганизмы и ферменты в ходе этого процесса гидролизуют жиры, белки и некоторые другие вещества молодого сыра. В результате их распада образуются вещества, придающие сырам характерный вкус.
Из молочных продуктов проще всего получать масло. В зависимости от сорта производимого масла используют сливки с концентрацией от 30–32 до 30–40%. При их сбивании эмульсия масла в воде превращается в эмульсию воды в масле. При производстве масла для улучшения вкуса и лучшей сохранности используют особые культуры бактерий.
При изготовлении сметаны к сливкам добавляют 0,5–1% закваски, используемой при производстве масла. Далее продукт выдерживают, пока концентрация кислоты не достигнет 0,6%.
Известно, что некоторые люди не переносят лактозу. Для них можно выпускать молоко, обработанное β-галактозидазой – ферментом, который уменьшает содержание лактозы. Для этой цели нужно разработать недорогой промышленный способ производства такого молока. β-Галактозидазу получают из дрожжей, плесневых грибов и бактерий.
Хлебопродукты
Для производства хлеба до сих пор применяют в основном дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Обычно их растят в ферментерах периодического действия на мелассе (свекловичной или сахарного тростника). В простейшем случае готовят тесто, смешивая муку, воду, дрожжи и соль. При замесе слои теста перемещаются, создаются условия для образования пузырьков газа и подъема теста. Замешанному тесту дают возможность «подойти», а затем режут на куски нужного веса, формуют и выдерживают во влажной атмосфере. При выдержке и на первой, следующей за ней стадии выпечки образовавшиеся при замесе и формовке «зародыши» газовых пузырьков наполняются углекислым газом. Он выделяется в ходе анаэробного сбраживания глюкозы и мальтозы муки. Поднявшееся тесто выпекают. В ходе этого термического процесса крахмал желатинизируется, дрожжи погибают, и тесто частично обезвоживается. Помимо углекислого газа при анаэробном брожении образуются органические кислоты, спирты и эфиры. Все они заметно влияют на формирование вкуса хлеба.
Кроме хлебопечения, крахмал используют для получения низкомолекулярных углеводов. Гидролиз крахмала в промышленном масштабе осуществляется разными способами: только кислотой, кислотой и ферментами и только ферментами. В середине 60-х годов на смену кислотному и кислотно-ферментативному процессам пришел ферментативный способ переработки крахмала, основанный на последовательном применении α-амилазы B.subtilis и амилоглюкозидазы A.oryzae или A.niger. Кроме производства глюкозы, наиболее заметным успехом в этой отрасли промышленности был выпуск смесей глюкозы и фруктозы. Этот продукт известен под названием изоглюкозы или кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы. Изоглюкоза может заменять сахарозу в большинстве видов пищи. Изомеризация осуществляется ферментами из различных организмов. Выбор их определяется тем, насколько просто с ними работать, нуждаются ли они в кофакторах и стабильны ли (смотри «Основы инженерной энзимологии»).
Бродильные производства
Получение напитков путем спиртового брожения – одно из древнейших бродильных производств. Первыми из таких напитков были, видимо, вино и пиво. До появления работ Пастера в конце ХIХ в. о сути протекающих при брожении процессов и их механизмах было известно очень мало. Пастер показал, что брожение без доступа воздуха осуществляется живыми клетками дрожжей, при этом сахар превращается в спирт и углекислый газ.
С6Н12О6=2С2Н5ОН+2СО2
Тогда же было показано, что брожение осуществляется под действием каких-то веществ, находящихся внутри дрожжевых клеток. Одно из главных нововведений в области микробиологии брожения было предложено Хансеном. Хансен выделил чистые культуры дрожжей и использовал их в пивоварении; тем самым он стал пионером применения таких культур при производстве пива. Сбраживание осуществляется дрожжами рода Saccharomyces. В одних случаях используется природный сахар (например, содержащийся в винограде, из которого делают вино), в других сахара получают из крахмала (например, при переработке зерновых культур в пивоварении). Наличие свободных сахаров обязательно для спиртового брожения при участии Saccharomyces, так как эти виды дрожжей не могут гидролизовать полисахариды. Образование этилового спирта происходит по схеме Эмбдена – Мейергофа – Парнаса.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
