10345 (600374), страница 4

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

Для включения вектора в пермессивные клетки используют различные методы: трансформация, инфекция, микроинъекция.

Клетки, способные адсорбировать и поглощать вектор, называют компетентными. У таких клеток изменены свойства клеточной стенки: снижен поверхностный заряд и повышена чувствительность к осмотическому шоку.

Компетентность клеток можно повысить, используя соли кальциялибо совместно соли кальция, магния, рубидия. Кроме того, применяют глубокое замораживание и оттаивание, а также электропорацию (кратковременное воздействие электрического поля высокой напряженности, которое вызывает разрушение цитоплазматической мембраны с образованием пор).

1.3.8 Обнаружение рекомбинантного клона

Обнаружение рекомбинантных микроорганизмов проводят, используя встроенные в вектор маркеры (например, резистентности к какому-либо антибиотику).

Подробнее рассмотрим обнаружение рекомбинантного клона на примере рассмотренной выше плазмиды pBR322. В данном случае легко различить бактериальные клетки, не содержащие плазмиды (не растут в присутствии ампициллина и тетрациклина), клетки с плазмидой, не содержащей вставки клонируемой ДНК (растут в присутствии обоих антибиотиков), и клетки с рекомбинантными плазмидами (в зависимости от локализации вставки могут расти на среде только с одним из двух вышеупомянутых антибиотиков). Следовательно, наличие в векторных молекулах селектируемых маркеров резко повышает эффективность клонирования из-за возможности проведения быстрого отбора рекомбинантных плазмид на селективных питательных средах.

Помимо генов устойчивости к антибиотикам в качестве селектируемых маркеров используют и другие гены или их фрагменты. В частности, для этих целей часто применяются гены различных ферментов, присутствие которых в клетках в составе плазмиды обнаруживают по появлению соответствующей ферментативной активности.

2.Научно-исследовательская часть

2.1 Характеристика объекта исследования

Целью выполненной нами работы явилось получение Ad-вектора на основе генома аденовируса птиц CELO (chicken embryo lethal orphan или fowl adenovirus type 1) методом гомологичной рекомбинации в Escherichia coli ( E. coli, кишечной палочке).

Преимущества плазмиды, рекомбинирующей в Е. coli, перед плазмидами, рекомбинирующими в культуре клеток, следующие: легкость выращивания бактериальных клеток по сравнению с трудоемким процессом ведения культур перевиваемых или полуперевиваемых эукариотических клеток; менее жесткие условия стерильности при выращивании бактерий; дешевизна посевного бактериального материала.

В настоящее время аденовирусы (Ad) хорошо изучены в качестве этиологических агентов различных инфекционных заболеваний человека и животных как модели для многочисленных исследований в молекулярной биологии, включая изучение сплайсинга мРНК, репликации ДНК, транскрипции и клеточной трансформации. Ad широко применяют в качестве векторов для транзиентной экспрессии генов в клетках млекопитающих. Известно большое количество методов внесения изменений в геном Ad для создания векторов, способных трансдуцировать клетки млекопитающих in vivo, исследуется применение векторов на основе Ad человека в генной терапии. Векторы на основе генома Ad человека (Ad2, Ad5 и другие) имеют ряд недостатков: предсуществующий иммунный ответ организма человека на данные Ad, ограниченный спектр клеток, в которые Ad человека эффективно проникают; наращивание препаративных количеств Ad человека в культуре клеток является трудоемким и дорогостоящим процессом. В связи с этим вызывают интерес исследования, направленные на создание векторных систем на основе генома Ad животных, в первую очередь птиц, которые были бы способны проникать в различные типы клеток с большой эффективностью, на которые не было бы предсуществующего иммунного ответа в организме человека и наращивание которых в куриных эмбрионах было более технологичным и экономически выгодным.

По общей структуре вирус CELO сходен с вирусами млекопитающих, однако размер геномной ДНК у вируса CELO (44 тысячи пар оснований-т.н.п.) больше, чем у Ad5 (36 т.н.п.). Особенностью структуры капсида вириона CELO является наличие двух фиберов различной длины, отходящих от одного основания пентона, в отличие от большинства других Ad млекопитающих и птиц, имеющих один фибер. Известно, что CELO не способен к полноценному циклу репликации в клетках человека или млекопитающих и является по отношению к данным хозяевам дефектным. Была показана возможность получения Ad-вектора на основе генома CELO.

Преимуществами векторов на основе генома CELO являются отсутствие первичного иммунного ответа в организме человека и животных, большая пакующая емкость и более высокая физическая стабильность вирионов, чем Ad человека. Наращивание вируса CELO возможно в куриных эмбрионах в

больших количествах (10 вирусных частиц из одного эмбриона), что значительно снижает стоимость получения препаративных количеств вируса.

2.2 Описание эксперимента

Для получения рекомбинантного аденовируса CELO методом котрансформации с ДНК вируса CELO дикого типа сконструированная плазмида должна содержать правый и левый фрагменты ДНК указанного вируса. Мы использовали плазмиду pCBEl, содержащую правый концевой фрагмент генома вируса CELO от 88.8 доЮО единиц карты (ед. к.). Участок генома от 95,3 до 99,7 ед. к., который не является существенным для репликации вируса, был делетирован из pCBEl по сайтам рестриктазы EcoRV. Указанным способом была получена плазмида pCBEARV. Полученная плазмида была подвергнута гидролизу рестриктазой Hind3 с последующим дефосфорилированием, а затем обработке олигонуклеотидом , содержащим сайт распознавания рестриктазы Рас 1.

Левый фрагмент вируса CELO был клонирован в плазмиду pGEM-T путем постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве праймеров были использованы олигонуклеотиды, содержащие следующие сайты рестрикции: первый - Bst и Pad, второй—Asc, Sfi и Есо721.Число циклов амплификации составило 15.

Следующий этап заключался в проведении гидролиза полученных плазмид; PacpCBEARV по сайту рестрикции Smal, CELOleftpGEM-T путем обработки рестриктазами Bstl 1071 и Есо721. Из полученных фрагментов была сконструирована плазмида, несущая правый и левый концы генома аденовируса CELO. Недостатком полученной плазмиды являлось наличие высококопийного ori ( ori—участок, в котором начинает расплетаться ДНК при помощи ДНК- полимеразы). Учитывая наличие двух сайтов рестрикции по Pad, ori было сменено при помощи рестрикции по указанным сайтам и последующим соединением липких концов образованного фрагмента с частью плазмиды pTG3601, гидролизованной также по двум сайтам Pad.

Полученная плазмида была рестриктирована по Ascl и котрансформирована с геномом вируса CELO по гомологичным участкам. Таким образом нами был получен Ad-вектор для экспрессии генов на основе генома аденовируса птиц CELO. Указанная схема представлена на рисунке 2.1.

2

2.3 Обработка экспериментальных данных

Плазмида с измененным ori была подвергнута наращиванию в Е. coli препаративных количествах. Для доказательства идентичности полученных плазмид с исходной был проведен рестрикционный анализ. В лунки 0.8% агарозного геля были внесены следующие пробы: в первую—маркер молекулярного веса (геном фага X, разрезанный рестриктазой РСТ, см. рисунок 2, б));

во вторую — плазмида, нарощенная в препаративных количествах; в третью - первоначально полученную плазмиду. По результату электрофореза, представленному на рисунке 2.2, можно судить об идентичности молекулярного состава указанных плазмид.

Плазмида, полученная после рекомбинации с геномом CELO и имеющая 48 тысяч пар оснований, была подвергнута обработке рестриктазой HindHI. Указанная рестриктаза активна при следующей комбинации нуклеотидов:

Количество сайтов рестрикции в полученной плазмиде и их местоположение указаны на рисунке:

Пробы после рестрикции были подвергнуты электрофорезу. В первую, вторую и третью лунку помещены целевые плазмиды, полученные из разных клонов Е. coli. В четвертую лунку помещена плазмида, неподвергавшаяся рестрикции, в пятую — маркер молекулярного веса.

Результаты рестрикционного анализа свидетельствуют об идентичности полученных фрагментов с ожидаемыми.

Заключение

В заключении данной работы рассмотрим наиболее существенные и практически значимые достижения рекомбинантной ДНК-биотехнологии, а также перспективы её развития.

Начиная с момента открытия двойной спиральной структуры а особенно после расшифровки генома человека, научные изыскания приносят значительные практические результаты, наиболее перспективные из которых следующие: конструирование рекомбинантных организмов-продуцентов жизненно необходимых лекарственных средств, получение которых альтернативными методами невозможно или сопряжено со значительными трудностями; разработка генетических вакцин; развитие генной терапии; применение трансгенных растений и животных для интенсификации сельского хозяйства.

Сравнение структур генов секвенированных к настоящему времени геномов человека, дрозофилы нематоды, дрожжей и бактерий приводит к выводу, что все живые существа действительно произошли от общего предшественника, так как родственные гены легко идентифицируются в геномах представителей всех трех царств живых организмов. Указанный факт теоретически обосновывает возможность встраивания и успешного функционирования чужеродных генов в организме. В настоящее время широкий спектр биологически активных веществ производится рекомбинантными организмами (соматотропин, инсулин, интерфероны, интерлейкин - 2).

Одним из самых современных и перспективных направлений биотехнологии является разработка генетических вакцин. Преимуществом генетических вакцин является возможность фокусирования иммунного ответа на одном или нескольких определенных антигенах возбудителя, что принципиально невозможно при использовании традиционных вакцин и не происходит при течении инфекционного процесса, а также возможность их использования не только в превентивных, но и в терапевтических целях для лечения аутоиммунных заболеваний, аллергий и злокачественных новообразований.

К терапии нового поколения относится генная или клеточная терапия основанная на превращении стволовых клеток в любые другие необходимые для организма клетки. В настоящее время указанная выше методика находится в стадии разработки, но имеет реальную перспективу.

Литература

1. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки в 3-х томах. — М.: Мир, 1994. — 1558 с. — ISBN 5-03-001986-3.

2. Докинз Р. Эгоистичный ген. — М.: Мир.[82]

3. История биологии с начала XX века до наших дней. — М.: Наука, 1975. — 660 с.

4. Льюин Б. Гены. — М.: Мир, 1987. — 1064 с.

5. Пташне М. Переключение генов. Регуляция генной активности и фаг лямбда. — М.: Мир, 1989. — 160 с.[83]

6. Уотсон Дж. Д. Двойная спираль: воспоминания об открытии структуры ДНК. — М.: Мир, 1969. — 152 с.

7. Burgers P, Koonin E, Bruford E et al. (2001). «Eukaryotic DNA polymerases: proposal for a revised nomenclature». J. Biol. Chem. 276 (47): 43487-90. PMID 11579108

8. Авторозов Е.К. Лекции по микробиологии и биотехнологии – М.: Эксмо, 2000

9. Елинов М.П. Основы биотехнологии – М.: Москва, 2004

10. Егорова Н.С. Биотехнология. Учебное пособие для ВУЗов – М.: Просвещение, 2009.

Характеристики

Список файлов курсовой работы