Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

КПN отщепляет остатки аргинина и лизина с C-конца различных синтетических пептидов, при этом скорость расщепления субстратов, содержащих C-концевые остатки лизина в 5-6 раз выше, чем соответствующих пептидов с C-концевым аргинином [57]. КПN отщепляет C-концевые остатки аргинина и лизина от многих природных пептидов и белков: брадикинина (значение K_m по данным разных авторов составляет от 0,4 до 19 мкМ), Met⁵-энкефалин-Arg⁶ (K_m = 49 мкМ) [69], Leu⁵-энкефалин-Arg⁶ (K_m = 57 мкМ), Met⁵-энкефалина-Lys⁶ (K_m = 216 мкМ), анафилотоксинов [49], креатинкиназы [75], -енолазы [76], фибринопептидов .

Несмотря на многолетнюю историю изучения КПN, её биологическая роль во многом остаётся неясной. Фермент вначале был описан как карбоксипептидаза, инактивирующая брадикинин и, следовательно, способная вовлекаться в регуляцию артериального давления и тонуса кровеносных сосудов. Однако показано, что реальный вклад фермента в инактивацию брадикинина in vivo не превышает 10-12%. Вместе с тем, некоторые авторы предполагают, что КПN может играть роль модулятора действия брадикинина [55, 69].

Активность КПN изменяется при воспалении, при некоторых видах астмы, послеоперационных осложнениях. Поскольку фермент расщепляет пептиды, участвующие в развитии воспалительных реакций (брадикинин и анафилотоксины), и его активность в крови снижается при введении рекомбинантного интерлейкина-1, вероятно, что КПN вовлекается в развитие воспалительных реакций [48].

Так как активность фермента повышается в моче больных с первичным альдостеронизмом, то, возможно, что активность КПN в почках может регулироваться альдостероном. Не исключено, что фермент может играть некоторую роль в регуляции водно-солевого обмена в почках.

Поскольку очищенная КПN способна уменьшать связывание плазминогена с клетками, хотя и не уменьшает скорости полного лизиса сгустка крови, можно предположить, что она вовлекается в процессы коагуляции крови. Однако, её реальный вклад в этот процесс in vivo пока не ясен.

Таким образом, несмотря на предположения, что КПN возможно вовлекается в регуляцию артериального давления, тонуса кровеносных сосудов, развитие воспалительных реакций, процессы свёртывания крови, её биологические функции не совсем ясны. Представляется возможным, что она вносит вклад в расщепление многих эндогенных субстратов и регуляцию многих физиологических процессов, однако в подавляющем большинстве случаев она не является единственным ферментом, участвующем в том или ином процессе. Вместе с тем, разнообразные функции вызывают интерес к изучению фермента при самых различных состояниях организма, в том числе связанных с нарушениями гемостаза [10].

В связи с этим представляет интерес изучения активности КПN в сыворотке крови онкологических больных в раннем послеоперационном периоде.

гемостаз онкологический больной карбоксипептидаза

1.2.4 Изменения в пептидергической системе онкологических больных

Интерес к изучению протеолитических ферментов при злокачественных новообразованиях обусловлен их разнообразным влиянием на процесс канцерогенеза [13, 15]. В работе И. Л. Вовчука, А. Е. Дизика, М. Г. Ануфриева и др. было проведено сравнительное изучение протеиназной активности сыворотки крови у женщин с онкологическими заболевания эндометрия, при этом установлена обратнопропорциональная зависимость между активностью трипсиноподобных протеиназ в сыворотке крови и степенью дифференциации злокачественной опухоли. При гиперплазии наибольшая активность трипсиноподобных протеиназ в сыворотке крови наблюдается при аденоматозе, а наименьшая – при эндометриозе [15].

Наличие злокачественной опухоли в матке характеризовалось увеличением активности трипсиноподобных протеиназ в сыворотке крови по сравнению с показателями доноров: у женщин в возрасте от 51 до 60 лет – в 1,24 раза, у женщин в возрасте от 61 до 70 – в 2,0 раза. По сравнению с доброкачественными опухолями активность исследуемых протеиназ при наличии злокачественного процесса была выше в 1,4 раза. Следует отметить, что у больных старше 70 лет установили значительно более высокую (в 3,78 раза) протеиназную активность при наличии злокачественной опухоли. В то же время в этой возрастной группе показатели протеиназной активности как при наличии доброкачественного, так и злокачественного процесса, были в 3,3 и в 2,0 раза ниже, чем в других возрастных группах. Это можно объяснить, вероятнее всего, снижением скорости метаболических процессов, свойственных данному возрасту [31].

Снижение протеиназной активности в сыворотке крови при наличии доброкачественной опухоли и увеличение этого показателя в случае злокачественной опухоли может свидетельствовать, с одной стороны, о неспецифичности ответной реакции организма, а с другой - об отличии протеиназ тканей доброкачественной и злокачественной опухолей.

На основании полученных исследоватили предполагают, что наличие достаточно высокой активности трипсиноподобных протеиназ (выше 36,00 нмоль/мин на 1 мг белка) может свидетельствовать о плохом прогнозе заболевания и, вероятно, показания протеиназной активности свыше 100,00 нмоль/мин на 1 мг белка могут свидетельствовать об активно идущих процессах трансформации клеток, которые наблюдаются при аденоматозе (cancer in situ) [6, 15, 41].

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1 Материал исследования

Активность ферментов определяли в сыворотке крови онкологических больных. Кровь брали в первый день после операции из локтевой вены, далее ее инкубировали 30 минут при комнатной температуре, центрифугировали 20 минут при 4000g и получали сыворотку, в которой определяли активность карбоксипептидазы N и ангиотензинпревращающего фермента.

Изучение активности ферментов было проведено у 45 мужчин в возрасте от 49 до 70 лет. Больные были оперированы по поводу опухолей легких, брюшной полости и мочеполовой системы. Они составили три экспериментальные группы. Первая группа – больные торакального отделения (18 человек); вторая – абдоминального отделения (15 мужчин); третья – урологического отделения (12 человек).

Параллельно с нашим исследованием Корниенко Е. М. проводилась работа по определению параметров гемостаза у онкологических больных данных групп, которые мы использовали в своей работе.

2.2 Методы исследования

2.2.1 Метод определения активности карбоксипептидазы N

Активность КПN определяли в сыворотке крови нингидриновым методом [62].

Опытные пробы содержали 20 мкл 3,5 мМ раствора CoSO₄, приготовленного на 100 мМ Трис-HCl буфере, pH 7,6 и 40 мкл препарата фермента. Контрольные пробы содержали 20 мкл 100 мМ Трис-HCl, pH 7,6 и 40 мкл препарата фермента. Пробы преинкубировали 8 мин при 37^oC, реакцию начинали прибавлением в опытные пробы 10 мкл гиппурил-арг, приготовленного на 100 мМ Трис-HCl буфере, pH 7,6 (конечная концентрация в пробе 5 мкМ). Реакцию проводили 120 мин при 37^oC и останавливали прибавлением 30 мкл 10 % трихлоруксусной кислоты.

Пробы центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин, отбирали 50 мкл надосадочной жидкости, приливали 1 мл нингидринового реактива. Далее пробы встряхивали, выдерживали 12 мин на кипящей водяной бане и измеряли оптическую плотность на КФК-2 при 595 нм против H₂O [58].

Активность КПN определяли как разность оптической плотности опытных и контрольных проб и выражали в нмоль аргинина, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.

Концентрацию белка в пробах определяли биуретовым методом.

2.2.2 Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента

Активность АПФ определяли в сыворотке крови нингидриновым методом по образованию гли-арг из кбз-гли-гли-арг при рН 8,2 как активность, ингибируемую каптоприлом. Препарат фермента (40 мкл) смешивали с 20 мкл 35 мкМ каптоприла в 100 мМ Трис-НСl буфере, рН 8,2, или 20 мкл буфера и преинкубировали 8 мин при 37˚С. Реакцию начинали прибавлением 10 мкл раствора кбз-гли-гли-арг в вышеуказанном буфере (конечная концентрация в пробе 5 мкМ). Через 120 мин реакцию останавливали прибавлением 30 мкл 10% раствора трихлоруксусной кислоты [59]. Пробы центрифугировали 30 мин при 4000 об/ мин. Отбирали 50 мкл надосадочной жидкости и определяли количество образовавшегося гли-арг нингидриновым методом [62]. Пробы колориметрировали на КФК-2 при =590 нм. Активность АПФ определяли как разность в оптической плотности проб не содержащих и содержащих каптоприл. Активность фермента выражали в нмоль гли-арг, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.

Концентрацию белка определяли биуретовым методом.

2.2.3 Метод определения содержания белка

Содержание общего белка определяли биуретовым методом. Принцип метода основан на том, что ионы меди в щелочной среде взаимодействуют с пептидными связями белков сыворотки крови с образованием комплекса красного цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации общего белка.

Опытные пробы содержали 50 мкл сыворотки крови и 2,5 мл рабочего раствора биуретового реагента (концентрат биуретового реагента развести дистиллированной водой в соотношении 1:19). Контрольные пробы содержали 50 мкл дистиллированной воды и 2,5 мл рабочего раствора биуретового реагента. В калибровочную пробу добавляли 50 мкл калибровочного раствора общего белка (раствор бычьего сывороточного альбумина с концентрацией 60 г/л с добавлением хлористого натрия 9 г/л и азида натрия 1 г/л).

Содержимое пробирок тщательно перемешивали, избегая образования пены, инкубировали при комнатной температуре (+ 18 - 25 С) в течение 30 минут, после чего измеряли величину оптической плотности калибровочной и опытных проб против контрольной пробы при длине волны 540 нм.

Концентрацию общего белка рассчитывали, как отношение оптической плотности опытной пробы к оптической плотности калибровочной пробы умноженная на концентрацию общего белка в калибровочном растворе (60 г/л).

2.3 Статистическая обработка результатов исследования

Достоверность отличий между средними определяли с использованием t-критерия Стьюдента [16, 29, 40]. Корреляционный анализ проводили с помощью программы «Статистика» (версия 6.0).

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1 Исследование активности карбоксипептидазы N в сыворотке крови онкологических больных в раннем послеоперационном периоде

Результаты исследования показали увеличение активности КПN в сыворотке крови онкологических больных торакального и абдоминального отделения в ранний послеоперационный период по сравнению с пациентами урологического отделения (рис. 1).

Рис. 1. Активность КПN у онкологических больных в ранний послеоперационный период (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка, Mm, n=1218; достоверность отличий: ** – р < 0,01, *** – р < 0,001 относительно урологической группы).

КПN локализован в плазме крови, обнаружен в стенках кровеносных сосудов. Легкие, желудочно-кишечный тракт имеют обширную капиллярную систему, после операции происходит повреждение этой системы, и вероятно, выход фермента в кровяное русло, что в итоге приводит к увеличению его активности [60].

При проведении корреляционного анализа (табл. 3), была выявлена отрицательная взаимосвязь между активностью КПN и ХЗФ у больных абдоминального отделения. В процессе свертывания крови калликреин расщепляет высокомолекулярный кининоген до активного кинина, который повышает чувствительность фактора XI к действию фактора XIIа [48]. Известно, что КПN участвует в деградации брадикинина [74], вероятно, увеличение активности этого фермента у данной группы больных может способствовать уменьшению свертывания крови по внутреннему пути. Кроме того, фактор Хагемана может включаться в фибринолиз, снижая время лизиса фибринового сгустка.

Обнаружена положительная корреляционная взаимосвязь между активностью КПN и уровнем фибриногена у пациентов урологического отделения. Фибриноген относится к острофазным белкам, концентрация которого резко возрастает в послеоперационный период, что усиливает тромбообразование на данном этапе [8]. Этот белок определяет вязкость плазмы крови, повышает агрегацию тромбоцитов и эритроцитов. Под действием тромбина из фибриногена образуются фибрин-мономеры, из которых впоследствии образуются фибриновый сгусток. Чрезмерное увеличение фибриногена может приводить к повышенному тромбообразованию. КПN, участвуя в инактивации брадикинина, вероятно, сдерживает активацию свертывания крови по внутреннему пути, тем самым способствуя поддержанию фибриногена на нормальном уровне у данной группы больных.

Таблица 3 Корреляционные взаимосвязи параметров гемостаза и карбоксипептидазы N

Достоверность корреляционных взаимосвязей: *– р < 0,05.

Характеристики

Список файлов ВКР