93286 (590108), страница 2

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

В последнее время установлено, что в мозге таурин играет роль нейромедиаторной аминокислоты, тормозящей синоптическую передачу, обладает противосудорожной активностью, оказывает также кардиотропное действие.

Таурин используется в медицине и пищевой промышленности, но в последние годы стал обычным компонентом для напитков (тоники), соков. Используется как биологически активная добавка (БАД), а также добавляется в корма для животных, особенно – для кошек. Таурин часто вводят в состав комплексных лекарственных препаратов, БАД. Он является основным действующим веществом препарата «Тауфон».

Основные физиологические функции таурина:

1. Таурин в составе таурохолевых (желчных) кислот необходим для всасывания липидов и жирорастворимых витаминов в кишечнике. В свободном виде он необходим для нормальной физиологической активности любой клетки организма.

2. Таурин защищает клетку от сморщивания, если состав электролитов во внеклеточной среде выше нормы, и от набухания, если концентрация электролитов ниже нормы.

3. Таурин регулирует внутриклеточный кальций. Он понижает концентрацию Са2+, предотвращая некротические изменения при избытке этого иона, и повышает Са2+, если уровень кальция в клетке ниже нормы и его не хватает для физиологической активности.

4. Таурин защищает клеточную мембрану, регулируя её состав и жёсткость.

5. Таурин участвует в воспалительных ответах организма и, крайне необходим для защиты клеток крови. Он обладает детоксикационными свойствами, нейтрализует сильный окислитель гипохлорную кислоту, которая генерируется при окислительном взрыве нейтрофилов (как известно, эти клетки участвуют в иммунном ответе).

1.1.3 Названия препаратов с действующим веществом таурин* (тaurine*)

Дибикор (Dibicoram); Тауфон – АКОС (Tauranumx – AKOS); Тауфорин раствор 4%; Таурин (Taurin); Тауфона раствор 4% (глазные капли) (Solutio Таufoni 4%); Тауфон (Taufonum); Тауфона таблетки (Tabulettae Taufoni).

Препарат «Тауфон»

Латинское название: Taufonum (2-Аминоэтансульфоновая кислота).

Фармакологические группы: Белки и аминокислоты. Другие метаболики. Действующее вещество (международное непатентованное название) таурин* (тaurine*).

Фармакологические свойства: Тауфон относится к аминокислотным препаратам, стимулирующим репаративные и регенеративные процессы при заболеваниях сетчатки глаза дистрофического характера, травматических повреждениях тканей последнего, патологических процессах, сопровождающихся резким нарушением метаболизма этих тканей. Как серосодержащая аминокислота препарат способствует нормализации функций клеточных мембран, оптимизации энергетических и обменных процессов, поддержанию постоянства электролитного состава цитоплазмы клеток, торможению синоптической передачи.

Применение: Дистрофические поражения сетчатой оболочки глаза, в том числе наследственные тапеторетинальные дегенерации, дистрофии роговицы, катаракта, травмы роговицы, открытоугольная глаукома, сердечно-сосудистая недостаточность различной этиологии (в том числе на фоне интоксикации сердечными гликозидами). Также назначается при лечении органа зрения совместно с другими препаратами.

Противопоказания: Повышенная индивидуальная чувствительность к препарату.

Побочные действия: Аллергические реакции.

Форма выпуска: Для медицинского применения таурин выпускается в виде 4% водного раствора под названием «Тауфон» во флаконах из бесцветного стекла по 5 мл или 10 мл и в ампулах по 1 мл. Хранение: в прохладном, защищенном от света месте. 10 мл препарата содержат 0,4 г таурина. Этот препарат выбран нами для исследований, потому что отпускается без рецепта врача. Используется в виде бесцветного прозрачного стерильного раствора с рН 5-6,5.

1.2 Методы определения аминокислот

Поскольку таурин часто рассматривают в ряду аминокислот, в нейтральной среде он существует в виде цвиттер-иона. Поэтому для его определения целесообразно рассмотреть методы анализа аминокислот.

В настоящее время разделение и определение аминокислот в различных биологических объектах является важной задачей клинической биохимии и аналитической химии. В связи с этим быстро развиваются методы анализа аминокислот и их смесей. К таким методам относятся: метод обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуоресцентным или электрохимическим детектированием [6,7] (способы пред- и постколоночной дериватизации аминокислот), реакция с о-фталевым альдегидом в присутствии нуклеофильных агентов, которую широко используют для чувствительного электрохимического, спектрометрического и флуориметрическое анализа аминокислот [8], метод капиллярного электрофореза [9], метод алкалиметрического титрования [10,11] и др.

В ВЭЖХ аминокислоты определяют с использованием различных детекторов: УФ, лазерного флуориметрического (ЛИФ), электрохимического, а также рефрактометрического. Все методы детектирования, кроме последнего, требуют предварительной процедуры дериватизации. Для получения производных аминокислот с целью их последующего определения используют такие соединения, как о-фталевый альдегид, фенил-изотиоцианат (УФ-детектирование), флуоресцеин-изотиоцианат, флуоресцамин (ЛИФ-детектирование).

Серосодержащие аминокислоты обычно определяют методами хроматографии [12], потенциометрии, а также иодометрическим титрованием. Среди электрохимических методов анализа для определения серосодержащих аминокислот широко применяют вольтамперометрию [13,14,15].

Аминокислоты и пептиды можно легко обнаружить методом хроматографии на бумаге или в тонком слое целлюлозы, используя небольшие количества материала. Бумажная и тонкослойная хроматография чаще используются для качественного анализа. Для определения используются различные буферы и органические растворители, при использовании которых достигается разделение аминокислот при одномерном фракционировании. Не разделенные аминокислоты могут быть разделены в результате проведения хроматографии при других pH во втором (перпендикулярном) направлении. Среди реагентов дающих широкий диапазон цветов при взаимодействии с аминокислотами можно отметить: нингидрин, флуоресцамин, изатин. Аминогруппы могут реагировать со свободными альдегидными группами, содержащимися в бумаге. Образующиеся основания Шиффа дают синюю флуоресценцию в УФ-свете. Йод не вызывает разрушения аминокислот. Хлор пригоден для определения N–блокируемых аминокислот [2]. Быстро развивается лигандообменный хроматографический анализ аминокислот и пептидов на силикагельных сорбентах в присутствии ионов меди.

1.2.1 Метод кислотно-основного титрования

Методы кислотно-основного титрования [10,11] основаны на использовании реакции между кислотами и основаниями. Алкалиметрическое титрование (щелочами) применяют для определения сильных и слабых кислот, кислых солей, солей слабых оснований и органических соединений, обладающих кислыми свойствами (кислоты, фенолы). Органические (слабые) кислоты способны оттитровываться раствором NaOH, причем образующийся анион кислоты вступает в реакцию гидролиза, и среда становится щелочной:

RCOOH + OH– Н2O + RCOO–.

Таурин, вследствие амфотерного характера не удается непосредственно титровать раствором щелочи. Титрование оказывается возможным, если блокировать аминогруппу действием формальдегида:

H2N—(CH2)2—SO3OH + CH2O = CH2=N—(CH2)2—SO3H + Н2O.

Образующееся соединение можно титровать алкалиметрически с индикатором фенолфталеином в соответствии с уравнением реакции [5]:

CH2=N—(CH2)2—SO3H + NaOH CH2=N—(CH2)2—SO3Na + Н2O.

1.2.2 Анализ аминокислот методом тонкослойной хроматографии

Разработка методов количественного и качественного анализов аминокислот (АК) является важной задачей многих отраслей науки: медицины, биохимии, микробиологии, пищевой промышленности, фармакологии и сельского хозяйства. В настоящее время наиболее эффективно при массовых анализах может быть использована тонкослойная хроматография [12] (ТСХ). Денситометрия применяется для количественной тонкослойной хроматографии в качестве альтернативы методу высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), требующей дорогостоящего оборудования и расходных материалов. Применяют методы разделения свободных аминокислот и их производных с использованием одномерного и двухмерного вариантов тонкослойной хроматографии с последующей денситометрической обработкой хроматограмм. Программа "Dens" позволяет обрабатывать хроматограммы, полученные в двух вариантах с относительной погрешностью не более 3%. Двухмерная ТСХ дает возможность разделить большое количество соединений (до 22 наиболее важных аминокислот, в том числе и таурин) на коротком расстоянии проявления (стандартная пластина размером 10х10 см). Одномерная ТСХ позволяет анализировать до десяти и более образцов аминокислот одновременно. В работе [12] показана возможность разделения смеси 22-х свободных аминокислот методом двухмерной ТСХ (рис. 1.1).

Рис. 1.1. Вид хроматограммы при ТСХ – разделении аминокислот с использованием нингидрина как проявителя.

В последнее время широко используются AAA-Direct [17] системы для анализа аминокислот. Для такого анализа, характерна комбинация анионо-обменной хроматографии и амперометрического определения.

Достоинствами этого метода являются:

• Пределы определения от минимального до среднего диапазона (в пикомолях), без дериваций.

• Приблизительно в 50 раз более чувствительный, чем анализ на основе нингидрина, и конкурентоспособный с методом предколоночной деривации.

• Определяет аминокислоты, фосфоаминокислоты, углеводы, аминосахариды – за один отбор.

• Быстрый количественный анализ аминокислот, таких как триптофан и серосодержащие аминокислоты.

BioLC® AAA-Direct конфигурация анализа аминокислот – усовершенствованное определение аминокислот. В отличие от других существующих методик, аминокислоты определяются непосредственно. С высокочувствительной, встроенной функцией импульсного амперометрического определения нет необходимости в предварительной или постколоночной деривации. Такая функция предлагает прямое определение первичных и вторичных аминокислот, аминосахаридов, фосфоаминокислот и основных продуктов окисления серосодержащих аминокислот (напр. цистеиновая кислота) в фемтомолях – пикомолях пределах диапазона определения с чувствительностью в 50 раз выше, чем в методике, основанной на нингидрине.

1.2.3 Электрохимические методы определения аминонокислот

Метод обращенно-фазовой ВЭЖХ с электрохимическим детектором [6] позволяет определить аминокислоты на уровне пикомоль. По этому методу можно определить 15 аминокислот в сыворотке крови человека. Так как немодифицированные аминокислоты не обладают электрохимической активностью, для детектирования их переводят в производные. Разделение производных проводят в градиентном или изократическом режимах элюирования. Из реагентов для получения производных только о-фталевый альдегид (ОФА), нафталин-2,3-дикарбоксиальдегид и 7-фтор-4-нитробензо-2-окса-1,3-диазол образуют с аминокислотами производные, обладающие электрохимической активностью. В качестве серосодержащих компонентов о-фталевого реагента используют 2-меркаптоэтанол или сульфит натрия. Общая продолжительность разделения 80 мин. Пределы обнаружения 0,5-5 пмоль. Методика применена для определения глутаминовой кислоты, аспарагина, серина, глутамина, гистидина, таурина, аланина, аргинина, метионина, изолейцина, орнитина, лейцина, фенилаланина, лизина и триптофана в сыворотке крови человека.

Для анализа нейромедиаторных аминокислот в реальных объектах используют обращено-фазовую ВЭЖХ с флуоресцентным или электрохимическим детектированием [7]. И поскольку, аминокислоты – нелетучие, неокрашенные соединения, слабо поглощающие в ультрафиолетовой области спектра, для их обнаружения также используется перевод в производные, обладающие флуоресцентной и электрохимической активностью. Наиболее широко применяется способ пред- и постколоночной дериватизации аминокислот, содержащих первичную аминогруппу, является образование изоиндолов при реакции с о-фталевым альдегидом и тиолами. Используя данную методику, можно в режиме изократического элюирования количественно определить глутаминовую кислоту, аспарагин, серин, глутамин, гистидин, таурин, аланин, аргинин и гаммааминомасляную кислоту в спинномозговой жидкости за 55 мин. Предел обнаружения 0,5-10 пмоль.

Реакцию о-фталевого альдегида с аминосодержащими соединениями в присутствии нуклеофильных агентов широко используют для чувствительного электрохимического, спектрометрического и флуориметрическое определения аминокислот [8]. В результате этой реакции образуются интенсивно флуоресцирующие продукты. С аминокислотами реакция идет по схеме:

Характеристики

Список файлов ВКР