1631210430-623e3b4173fff8521a1609fcf7a1977a (558207)
Текст из файла
ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ.Определение последовательности аминокислот в пептидах и белкахОбратите внимание! Необходимо выполнять домашнее задание!Вопросы задаются в слайдах презентации. Они помечены красным жирным шрифтом.Кому недостаточно материала презентации, загляните на стр. учебника Д.Г. Кнорре, Т.С.Годовикова. С.Д. Мызина, О.С. Федорова «Биоорганическая химия».
Учебник: Северин«Биохимия».Что нужно знать после лекции.Задачи, на решение которых направлено определение первичной структуры пептидов и белков. Корреляция между структурой ибиологической активностью белков.Общая стратегия определения первичной структуры белков. Основные этапы определения последовательности аминокислот вбелках: выделение белка; получение кислотного гидролизата белка и определение мольного соотношение входящих в негоаминокислот; определение молярной массы и вычисление количества всех присутствующих аминокислотных остатков.Определение состава белковых олигомеров: получение мономеров полипептидных цепей.
Методы идентификации олигомеров:электрофорез в полиакриламидном геле, гель-фильтрация. Идентификация индивидуальных полипептидных цепей. Определениесостава олигомера по молекулярным массам мономеров. Определение числа мономеров в олигомере путем “сшивания” субъединицбифункциональными реагентами.Идентификация N- и C-концевых аминокислотных остатков. Реагент Сэнгера для определения N-концевой аминокислоты.Фрагментация полипептидной цепи ферментативными методами. Гидролиз сериновыми протеазами. Механизм. Использованиехимических методов для изменения специфичности ферментативного гидролиза.Фрагментация полипептидов химическими методами.
Бромциановый метод расщепления по остаткам метионина. Окислительноегалогенирование. Расщепление с помощью N-бромсукцинимида.Методы анализа аминокислотной последовательности пептидов. Метод Эдмана для секвенирования пептидов. Проблемы прианализе фосфорилированных аминокислот и -карбоксиглутаминовой кислоты.Применение масс-спектрометрии при определении первичной структуры пептидов и белков. Масс-спектрометрический анализ смесипептидов, образующихся при специфическом гидролизе белка. Банки данных для последовательностей аминокислот в белках.
MS/MSсеквенирование. Анализ посттрансляционного процессинга методом масс-спектроскопии. (Лекции В.В Коваль).Установление первичной структуры белков по кодирующей последовательности в ДНК. Скрининг банков генов. Секвенированиекодирующей последовательности. Сопоставление структуры пептидов с кодирующими последовательностямиПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВСПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРВИЧОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВПервичную структуру белков можно определить двумя способами:1) с помощью генетического кода по расшифрованной нуклеотиднойпоследовательности кодирующей м РНК или соответствующего гена (впоследнем случае после установления структуры экзонов;2) Путе непосредственного анализа аминокислотной последовательности.В качестве иллюстрации первого подхода можно привести выявление мутации вгене, кодирующем бета-цепь гемоглобина, которая приводит к тяжеломузаболеванию – серповидноклеточной анемии.
На участке генома, где происходитмутация, на транскрибируемой нити кодон заменен на САС, что приводит кзамене тринуклеотида GAG в мРНК на тринуклеотид GUG. В соответствии сгенетическим кодоном это приводит к замене остатка глутаминовой кислоты наостаток валина, что как раз и является причиной изменения свойств гемоглобина.НЕПОСРЕДСТВЕННОЕСЕКВЕНИРОВАНИЕ БЕЛКОВУСТАНОВЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВПост-колоночная детекция аминокислотУСТАНОВЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГОСОСТАВА ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВПолученный гидролизат разделяют на индивидуальные аминокислоты,используя, например, катионообменную хроматографию. Подавляющее числоаминокислот не обладает характерными спектрами поглощения или испускания,их идентификация проводится на основании данных по времени удерживания натвердой используемой системе хроматографического разделения.
Посколькуаминокислоты бесцветны, то после разделения их обрабатывают нингидрином,который переводит аминокислоты в интенсивно окрашенные синие соединения.Как видно из приведенной на предыдущем слайде схемы реакции, структураконечного продукта реакции не зависит от природы аминокислоты. Поэтомуокрашивание проводится после разделения аминокислот. По структуре иокраске отличается только продукт взаимодействия с пролином, имеющийжелтую окраску.Поскольку при анализе аминокислотного состава приходится иметь дело сбольшим числом компонентов, то хроматография проводится в несколькоэтапов. Наиболее часто используемым элюентом является раствор цитрата.
Напервой ступени используется 0,2 М цитрат с рН 3,25. При этом последовательнос колонки выходят аминокислоты Asp, Thr, Ser, Glu, Pro. На второй ступениэлюентом служит 0,2М цитрат с рН 4,25. При этом с колонки последовательновыходят Gly, Ala, Cys, Val, Met, Ile, Leu. На последнем этапе с элюентом с рН5,28 и концентрации цитрата 0,35 М с колонки элюируются Lys, His, Arg.Как вы думаете, от чего зависит время удерживания на колонкеаминокислот?Другим реагентом для визуализации аминокислот является N,NДиметилАминоНафталин-5-СульфонИЛхлорид (дансилхлорид).Дансилированные аминокислоты обладают интенсивной флуоресценцией(максимум при 365 нм), что существенно облегчает их идентификацию и делаетподход высокочувствительным (можно определять несколько десятых долейнаномоля).УСТАНОВЛЕНИЕАМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВАПЕПТИДОВ И БЕЛКОВОпределение аминокислотного состава внастоящее время является рутиннойпроцедурой.
Она необходима не только приисследовании белков, но и при решенииприкладных задач, таких как определениепищевой ценности белков и их смесей,особенно содержание в них незаменимыхаминокислот, которые у ряда животныхорганизмов, в том числе у человека, несинтезируются и должны обязательнопоступать с продуктами питания. Поэтому внастоящее время этот анализавтоматизирован и проводится наспециальных аминокислотных анализаторах.Они представляют собой приборы дляжидкостной хроматографии, в которыхзапрограммированы определенная сменаэлюентов и проведение после хроматографииокрашивания разделенных аминокислотнингидрином..Определение состава белковых олигомеров.
Получение мономеров полипептидных цепей.ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕВЫХ АМИНОРУППАминогруппа N-концевого аминокислотного остаткаполипептида является единственной аминогруппой, неучаствующей в образовании пептидной связи. Для ееопределения может быть использован, например, 2,4динитрофторбензол (реагент Сэнгера).
В результатевзаимодействия с данным реагентом образуютсяокрашенные в желтый цвет 2,4-динитрофенильныепроизводные аминокислот.ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕВЫХ КАРБОКСИЛЬНЫХ ГРУПП В ПОЛИПЕПТИДАХКлассические реакции карбоксильных групп, такие какэтерификация и амидирование, не могут быть проведеныселективно по С-концевой карбоксильной группе,поскольку свойства последней не сильно отличаются отсвойств карбоксильных групп остатков аспарагиновой иглутаминовой кислот.
Поэтому для установления природыС-концевой группы в основном используется ееспособность образовывать оксазолон с карбонильнойгруппой предпоследнего аминокислотного остатка. СвязьС-Н в составе оксазолонового цикла, находящаяся междудвумя оттягивающими электронные пары фрагментами,относительно легко ионизируется и поэтому способнаселективно обменивать атом Н на атом дейтерия, чтопозволяет избирательно вводить радиоактивную метку в Сконцевой остаток.Еще один подход для определения С-концевойаминокислоты основан на реакции гидразинолизаполипептида. При обработке гидразином происходитпревращение всех аминоацильных остатков пептида, кромеС-концевого, в соответствующие гидразиды.
Непревращается в гидразид только С-концевая аминокислота,которую можно отделить от смеси гидрозидовионообменной хроматографией.Фрагментация полипептидной цепи ферментативными методамиСхема активного центра сериновых протеаз и механизм их действияХимотрипсин, трипсин, эластаза – сериновые протеазы,отличающиеся лишь специфичностью по отношению к природекарбонильного компонента расщепляемой пептидной связи.Каталитический центр протеаз представлен сериновой триадой– серином, гистидином и аспартатом. В случае химотрипсина –это Ser-195, His-57 и Asp-102.
Каталитическая активностьхимотрипсина определяется необычайно высокой реакционнойспособностью Ser-195. Находящиеся рядом карбоксилат-анионаспартата и имидазольная группа гистидина формируютсистему переноса заряда. Эта система играет ключевую роль вкатализе благодаря способности связывать протон иобеспечивает, с одной стороны, челночную передачу протона, ас другой – повышает нуклеофильный характер остатка серина вактивном центре.На первой стадии гидролиза пептидов химотрипсином (см.
а, б,в) – ацилирования – в результате атаки субстрата гидроксиломSer-195 образуется нековалентно связанное промежуточноесоединение, превращающееся в тетраэдрическоепромежуточное соединение. Затем оно распадается собразованием ацилфермента – промежуточного продуктакатализа, при этом расщепляется пептидная связь.На второй стадии гидролиза пептида (см. г, д) – деацилирования– ацилфермент гидролизуется с отщеплением N-концевой частипептида и одновременной регенерацией в активном центретриады аминокислот.Использование химических методов для изменения специфичности ферментативного гидролизаРеакции ацилирования по -аминогруппе лизинапозволяют блокировать действие специфичных к остаткамосновных аминокислот сериновых протеаз, что даетвозможность расщеплять белки избирательно только поостаткам аргинина. Ацилирование ангидридамидикарбоновых кислот приводит к замене положительногозаряда остатка лизина на отрицательный заряд полуамидадикарбоновой кислоты.
В зависимости от природыиспользуемого реагента модификация остатков лизинаможет быть как обратимой, так и необратимой. Обратимоеблокирование -аминогрупп лизина позволяетосуществлять последовательное расщепление белковоймолекулы трипсином: вначале только по статкамаргинина, а затем, после разделения образовавшихсяпептидов и удаления защитных групп, и по остаткамлизина. Для обратимой модификации чаще всегоиспользуется реакция с малеиновым или цитраконовымангидридами. Реакция ацилирования проводится при рН8,5-9,0 и температуре от 0 до +2 градусов в присутствии20-кратного избытка реагента. Малеильные производныелизина стабильны при нейтральных и щелочныхзначениях рН, а в кислой среде гидролизуются,регенирируя свободную -аминогруппу.Использование химических методов для изменения специфичности ферментативного гидролизаРеакция с 1,2-циклогексадиономиспользуется для раздельногорасщепления полипептидной цепи поостаткам аргинина и лизина.Модификация протекает в мягкихусловиях (рН 8,0–9,0, 25–40 градусов) внатрий-боратном буфере с образованиемстабильного комплекса производногоаргинина с боратом.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
