1631210430-623e3b4173fff8521a1609fcf7a1977a (558207), страница 2

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Модифицирующаягруппировка может быть удаленаобработкой 0,5 М гидроксиламином прирН 7,0, 37 градусах, что дает возможностьпроводить последующее расщеплениетрипсином по освобождающимся остаткамаргинина.СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДНЫХ ЦЕПЕЙПо указанному методу анализируемыйполипептид обрабатывается бромцианом,который атакует атом S остатков метионинас образованием цианосульфониевогопроизводного. Последнее благодаряналичию положительного заряда на атоме Sстановится эффективным алкилирующимреагентом, способным атаковать соседнююкарбонильную группу с образованиемиминолактона и одновременнымотщеплением метилизотиоционата.Иминолактон легко гидролизуется, чтоприводит к разрыву пептидной связи.СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ФРАГМЕНТАЦИЯ ПОЛИПЕПТИДНЫХ ЦЕПЕЙМетод селективного расщепленияпептидных связей остатка триптофанаоснован на высокой реакционнойспособности индольного ядра. При этомблагодаря низкому содержанию в белкахтриптофана должны образовыватьсянесколько крупных фрагментов, удобныхдля секвенирования.МЕТОД ПЕРЕКРЫАЮЩИХСЯ БЛОКОВУстановление порядка, в котором секвенированныефрагменты были расположены в исходном белке,проводится с помощью подхода.

Известного как методперекрывающихся блоков. Метод основан на проведениидвух ( в некоторых случаях большем) расщеплений белкапо двум точкам, отличающимся по природеаминокислотных остатков. Суть метода проще всегоуяснить на конкретных методах расщепления, допустим, напримере расщепления с помощью трипсина ихимотрипсина. Если два пептида, получившиеся врезультате специфического расщепления трипсином (Тпептиды), были соседними в анализируемом белке, тосреди пептидов, полученных расщеплением с помощьюхимотрипсина (С-пептид), должен находиться такой, Nконец которого совпадает с С-концом одного из двухсоседствующих Т-пептидов, а С-конец этого С-пептида – сN-концом второго Т-пептида.

Иными словами, двасоседствующих Т-пептида полностью перекрываютсякаким-либо С-пептидом. Аналогично два любыхсоседствующих С-пептида перекрываются каким-либо Тпептидом. При установленных первичных структурах непредставляет труда вручную установить всеперекрывающиеся пары, т.е. восстановить всю первичнуюструктуру белка или каждой из его субъединиц.Метод основан на реакции N-концевой -аминогруппы с фенилизотиоцианатом,пиводящей к превращению N-концевого аминоацильного остатка в Nфенилтиокарбамоильное производное, которое отщепляется в виде 2-анилино-5тиазолина с освобождением пептида, укороченного на один аминокислотныйостаток. Тиоазолин при подкислении превращается в фенитиогидантоин,соответствующий отщепленной N-концевой аминокислоте.

Фенилтиогидантоиныобладают интенсивным УФ-поглощением. Поскольку свойствафенилтиогидантоинов с различными радикалами R отличаются всоответствующим образом подобранных хроматографических системах, можноидентифицировать фенилтиогидантоин, а следовательно и отщепленнуюаминокислоту. Для большинства аминокислотных остатков удобным методомидентификации является масс-спектрометрический. Проведение ступенчатогоотщепления N-концевых аминокислотных остатков и их идентификация черезобразующиеся фенилтиогидантоины позволяет установить последовательностьэтих остатков в анализируемом пептиде.Проблемы при анализе фосфорилированных аминокислот и карбоксиглутаминовой кислоты – нестабильность их в условиях кислотнойобработки.Чисто химический подход ксеквенированию пептидов былразработан Эдманом (P.V. Edman), иметод носит его имя.Автоматическое секвенирование по методу ЭдманаСпецифической особенностью секвенирования пептидов по Эдмануявляется огромное число идентичных по типу реакций стадий, которыенеобходимо проводить на каждом этапе укорочения пептидной цепи.Методологически эта ситуация аналогична рассмотренной ранееприменительно к многоступенчатому синтезу олигонуклеотидов, ицелесообразна автоматизация процесса.

Поэтому созданы специальныеприборы для автоматического секвенирования по методу Эдмана(автоматические секвенаторы белков). В секвенаторах анализируемыйполипептид связан с нерастворимым носителем и через колонку санализируемым пептидом по заданной программе последовательнопропускаются раствор фенилизотиоцианата, растворитель для отмывки отизбытка реагента, раствор кислоты для превращения N-концевого остатка вфенилтиогидантоин и его отщепления от иммобилизованного пептида,последующее определение природы отщепившегося остатка и продолжениясеквенирования.В качестве нерастворимого носителя обычно используются полимерныематериалы, несущие алифатические аминогруппы, с которыми связываютсяконцевые карбоксильные группы секвенируемого белка.

Фрагментыанализируемого белка, полученные гидролизом белка специфическимипротеазами, имеют на С-конце карбоксильную группу. Присоединение такихпептидов к аминогруппам можно осуществить с помощью карбодиимида.При этом одновременно активируются карбоксильные группы остатков Aspи Glu, что неизбежно приведет к иммобилизации пептида по этим группам,это не позволило бы проводить процедуру Эдмана после первого же остаткаодной из дикарбоновых аминокислот. Избежать такого процесса можнопредварительным выдерживанием пептида с карбодиимидом. При этом Сконцевая группа превращается в оксазолон, который способен ацилироватьаминогруппы носителя, а активированные СООН-группы дикарбоновыхкислот переходят в неактивные производные N-ацилмочевины.При использовании бромцианового расщепления белка по остаткамметионина получаются пептиды с С-концевым оксазолоном, которые можнонепосредственно присоединять к аминогруппам носителя.АНАЛИЗ ПОЛОЖЕНИЯ ДИСУЛЬФИДНЫХ МОСТИКОВМасс-спектрометрический анализ смеси пептидов.Вспомните лекции В.В.

Коваль и посмотрите учебник Д.Г. Кнорре, Т.С. Годовикова. С.Д.Мызина, О.С. Федорова «Биоорганическая химия» стр. 183-185.В настоящее время интенсивное развитие приобрел массспектрометрический метод определенияпоследовательности аминокислот в пептидах. Оноснован на масс-спектрометрическом анализе смесипептидов, образованных при специфическом гидролизеанализируемого белка. Молекулярные ионы пептидов,имеющие одинаковую массу, аккумулируются в ионномисточнике масс-спектрометра, где подвергаютсяфрагментации и затем повторному массспектрофотометрическому разделению.

В связи сдвукратным масс-спектрометрическим разделениемтакой метод установления первичной структуры принятоназывать MS/MS-секвенированием (этот подход частообозначают как секвенирование de novo).Главным принципом при этом подходе являетсясравнение масс фрагментов, полученных в результатеоднократного разрыва анализируемого пептида при егофрагментации в ионном источнике масс-спектрометра.При фрагментации главным образом разрушаетсяпептидная связь.Масс-спектрометрический анализ смеси пептидов, образующихся при специфическом гидролизебелка.

Банки данных для последовательностей аминокислот в белках. Вспомните лекции В.В.Коваль и посмотрите учебник Д.Г. Кнорре, Т.С. Годовикова. С.Д. Мызина, О.С. Федорова«Биоорганическая химия» стр. 185-186..

Характеристики

Список файлов лекций