1631210429-6e37ee16e9132933744a4f4055b3cef5 (558206)

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла

ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ.АФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ И НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВОбратите внимание! Необходимо выполнять домашнее задание!Вопросы задаются в слайдах презентации. Они помечены краснымжирным шрифтом. Предложенные задания в презентации сдать до 1мартаКому недостаточно материала презентации, загляните на стр. учебника Д.Г.Кнорре, Т.С. Годовикова. С.Д. Мызина, О.С. Федорова «Биоорганическаяхимия».

Учебник: Северин «Биохимия».Что нужно знать после лекции.Химическая модификация белков. Подбор химических модифицирующих агентов.Пути повышения селективности химической модификации белков.Общие принципы конструирования аффинных реагентов. Типы реакционноспособных групп ваффинных реагентах. Способы их введения и механизмы модификации. Фотоактивируемыереагенты: перспективы и проблемы.Пути повышения селективности аффинной модификации. Каталитически компетентное мечение.Модификация с использованием бинарной системы фотоаффинных реагентов.Аффинная модификация как инструмент изучения механизма функционирования надмолекулярныхкомплексов. Примеры аффинной модификации в исследованиях репликационного,транскрипционного комплексов и рибосом.Химическая модификация функциональных групп в белкахХимические воздействия на белки инуклеопротеидные комплексы (химическаямодификация), как правило, приводят к потереими функциональной активности, еслимодифицируемые остатки принимают участиев формировании функционально значимыхобластей.

Поэтому химическая модификацияможет служить источником информации оструктурных основах функционированиябиополимеров. В первый период становлениямолекулярной биологии химическаямодификация в ее непосредственном видешироко использовалась для получениясведений о связи функций биополимеров с ихструктурой. Мы с вами познакомились с рядомреагентов, обладающих некоторойспецифичностью к определеннымфункциональным группам белков.Подбор бифункциональных реагентов для модификации белковРеагенты, содержащие две модифицирующие группировки (бифункциональные реагенты), способныприсоединяться к двум сближенным группам в составе одного белка или образовывать ковалентные связи сдвумя молекулами биополимеров, например, с антителом и ферментом. Использование фермента,способного превращать субстрат в окрашенный продукт, обеспечивает регистрацию сигнала послеобразования комплекса антиген-антитело при иммуноферментном анализе.Использование бифункциональных реагентов с «жестким» линкером, специфичных в отношенииаминогрупп, обеспечивает, например, модификацию определенных остатков лизина в белке.Подбор химических модифицирующих агентов для модификации ферментов1.

Высказывается предположение об аминокислотныхостатках, находящихся в активном центре ферментаили интересующем сайте,2. Осуществляется подбор реагентов, специфичных копределенным аминокислотам,3. Исследуется ковалентное присоединение реагента кбелку и стехиометрия присоединения,4.

Определяется уровень инактивации фермента, какследствие химического воздействия.RRСхема химической модификации. Х – модифицируемый остатокаминокислоты в активном центре, R – химический реагент.Подбор химических модифицирующих агентов для селективного мечения белковВ то же время химические реагенты, действующие на группыопределенного типа, модифицируют в той или иной степени всеоднотипные группы. Поэтому в большинстве случаев одновременно спревращением групп, участвующих в функционировании белка илинуклеопротеида, затрагиваются и другие группы того же типа, что взначительной мере обесценивает получаемую информацию.Рассмотрим подходы, позволяющие обеспечить селективнуюмодификацию определенных функциональных групп в белках.Клеточные системы синтеза белков, а также ферменты, могут внедрять в структурыбелков неприродные аминокислоты, ошибочно принимая их за природные.

Вчастности, было обнаружено, что замена метионина в питательной среде бактерий нагомопропаргилглицин (Hpg) или азидогомоаланин (Aha) позволила встроить этисинтетические аминокислоты в синтезируемые клеткой белки. Такие белки содержалибиоортогональные функциональные группы — азид либо алкин, и введение в клеткубиотина и флуоресцентных красителей, снабжённых комплементарнойфункциональной группой (фосфин, циклооктин либо азид) дало возможностьселективно пометить и изучить данные белки. Кроме того, азидогомоаланин игомопропаргилглицин были использованы одновременно для параллельноймодификации двух различных типов белков.Химическая модификация функциональных групп в белках.Подходы, позволяющие обеспечить селективную модификацию определенныхфункциональных групп в белках.Методы химической модификации IgG,фрагментов антител и белков на N- или CконцахTCEP–Tris(2-carboxyethyl)phosphine;DTT–dithiothreitol.Предложите механизмы для реакций,представленных на схеме с и d.Селективная химическая модификация сульфгидрильных групп в белкеВлияние рКa функциональных групп биополимеров на ихреакционную способностьИзменение рКa боковых радикаловаминокислотных остатков вследствие ихокружения в составе белков являетсяодним из главных факторов, определяющихих реакционную способность.Например, большинство аминокислотреагируют в непротонированной форме, азначения рКa для фyнкциональных групподинакового строения, в зависимости от ихокружения в молекуле белка, могутотличаться на 2 единицы.Модификация остатка серина протеаз, R=-СН2ОНДля модификации серина в активном центре протеаз:BrCH2C(O)NH2BrCH2COOHBr-ацетамидBr-уксусная кислотаICH2COOHI-уксусная кислотаПри рН 6-7 модификации подвергался остаток Ser, хотя при таких значениях рН серинизначально проявляет слабую нуклеофильность.В растворе такая реакция не пойдет, а в активном центре нуклеофильность серинасущественно повышается при помощи гистидина, оттягивающего на себя протон в пареSer-His (см.

следующий слайд).Схема активного центра сериновых протеаз и механизм их действияСелективная химическая модификация концевой аминогруппы в рекомбинантных белках.С развитием техники генной инженерии и производства белков с использованием рекомбинантных ДНК возникло новое направление аффиннойхроматографии, связанной с использованием хелатных сорбентов.

Оно основано на введении в транскрибируемый ген специальныхпоследовательностей, обеспечивающих в процессе трансляции синтез гистидиновых последовательностей размером 6-15 аминокислот, обладающихвысоким сродством к ионам переходных металлов, которые вводятся в качестве аффинных лигандов в состав сорбентов. Целевой продукт с высокойспецифичностью извлекается таким сорбентом из клеточного экстракта, выделяется в чистом виде. Наличие олигогистидинового фрагментаобеспечивает селективность модификации по концевой аминогруппе.Объясните, за счет чего обеспечивается селективность модификации концевой аминогруппы (см.на схеме).ЭпиВакКорона. GGSGHHHHHHSG.

Нуклеокапсидный белок коронавируса, экспресированный в E.coli (носитель- мальтоза-связывающий белок изкишечной палочки). Три пептида из S-белка коронавируса химически присоединены.Подходы, позволяющие обеспечить селективную модификацию определенныхфункциональных групп в белках.Дляполученияболееопределенныххимическихданных о связи функции соструктурой наиболее важноезначение приобрели методы,получившиеназваниеаффинной модификации.Основная идея метода состоитв использовании реагентов,которыенарядусреакционноспособной группойопределеннойхимическойспецифичностисодержатостаток,обладающийспецифическим сродством копределенному функциональнозначимомуучасткумодифицируемогобиополимера.Часть, обеспечивающая специфичноенековалентное связывание реагентас биополимеромАффинный реагентРеакционноспособная группа,за счет которой происходитковалентное присоединениереагента к акцептору в биополимереСхема классической модификацииБелок-мишень содержит лиганд–связывающий центрОбразование комплекса между меченымреагентом и белком-мишеньюОбразование ковалентной связимежду реакционноспособнойгруппой реагента и белком-мишеньюИдентификация модифицированнойчасти белкаСветлые овалы обозначают аффинную частьреагента; темные кружочки – реакционноcпособную группу реагента, а звездочки –метку, например, радиоактивную.Структурно-функциональный анализнадмолекулярных комплексовМетод аффинной модификации дляисследования надмолекулярныхкомплексов матричного биосинтезаМетод основан на применении реагентов,способных осуществить высокоспецифичнуюхимическую модификацию биологическихобъектов за счет предшествующего химическойреакции образования специфичного комплекса:реагентобъект модификации161.

Метод аффинной модификации, основанный наиспользовании реакционноспособных структур ДНК,имитирующихпромежуточныеинтермедиатыпроцессоврепарации,позволяетизучатьфункционирование ансамблей белков репарации.2. Аффинная модификация в сочетании с MALDI-MS прииспользовании на уровне экстрактов клеток и ядерпозволяет открывать новые белковые факторы,участвующие в этих процессах.3. Разработанныеметодыидентификациибелковрепарации в экстрактах клеток позволяют оцениватьстатус систем репарации.ПоврежденнаяДНКОстановкаРепарацияклеточногоДНКциклаАпоптоз программируемаяклеточнаясмертьМутацииРакМеханизмы повреждений и репарации ДНКалкилирующиеагентыспонтанные реакцииэндогенные окислителиактивные формы кислородаУФ-излучениемутагеныокружающей средырентгеновскоеизлучениеошибкирепликацииO6-meGапуриновые/апиримидиновые(АР-) сайтыокисленныедезаминированные иалкилированные основанияоднонитевые разрывыпиримидиновыедимерыкрупные аддуктыдвойныеразрывынеправильноеспариваниеоснованийвставки, делециипрямая репарациярепарацияоснованийрепарациянуклеотидоврепарациядвойныхразрывов ДНКрепарациянеправильноспаренныхоснованийБелки репарации ДНК, взаимодействующие сАР-участками (АР-сайтами) в ДНКАP-сайт вблизидвухцепочечного разрываАР-сайтАР-сайтГидролизованныйнапротив брешиАР-сайтВсе идентифицированные белки ответственны за чувствительность клеток к ионизирующемуизлучению.

Характеристики

Тип файла PDF

PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.

Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.

Список файлов лекций