Диссертация (1174244), страница 8
Текст из файла (страница 8)
В проточном цитометре свет преобразуется вэлектрическиесигналы,которыеобрабатываются,ивконечномопределяется количественная величина каждого измеряемого параметра.Оборудование и материалы- проточный цитометр Cytomics FC 500 (BeckmanСoulter);- центрифуга на 1500-2000 об/мин;- термостат;- одноразовые полистирольные пробирки;- Vortex Heidolph REAX 2000;- дозаторы объемом 10, 100, 1000 мкл;- физраствор.итоге49Проведение анализа1. Для каждого образца крови маркируется необходимое количествоодноразовых полистирольных пробирок.2. Внести по 50 мкл хорошо перемешанного образца на дно каждойпробирки.3. Добавить по 5 мкл моноклональных антител в каждую пробирку всоответствии с маркировкой, перемешать 5 сек на “Vortex”.4.
Инкубировать 15 мин при комнатной температуре в темноте. Перемешать5 сек на “Vortex”.5. Для лизиса эритроцитов в пробирки внести 250 мклOptilyse, перемешать5 сек на “Vortex”.6. Инкубировать 10 мин в термостате при 37С, перемешать 5 сек на“Vortex”.7. Добавить 250 мкл физраствора в каждую пробирку.После настройки прибора, выбора программы исследования и проведенияизмерений, согласно инструкции, перейти к анализу полученных результатов.Исследование начинается с анализа данных распределения изучаемой клеточнойпопуляции по каналам светорассеяния и выделения лимфоцитарного гейта.Необходимо стремиться к тому, чтобы максимальное количество событийрасполагалось в правом нижнем квадранте.Учет результатов осуществляется па основании анализа 10000 событий ивыражается в процентах клеток, несущих данный антиген.
При необходимости,зная лейкоцитоз и состав лейкоцитарной формулы, можно рассчитать абсолютноеколичество клеток, несущих тот или иной антиген.6. Циркулирующие иммунные комплексыНаборреагентов«ЦИК-ХЕМА»предназначендляопределенияциркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови человека методомиммунного турбодиметрического анализа.50Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) образуются и циркулируют вкровяном русле в ответ на введение агента (антигена). Они представляют собойкомплексы, состоящие из антител, антигена и компонентов комплемента.Уровень циркулирующих иммунных комплексов дает определенноепредставлениеобактивностииммунноговоспаленияиэффективностипроводимой терапии [8].
Повышение уровня ЦИК отмечается при диффузныхболезняхсоединительнойткани,подостроминфекционномэндокардите,системных васкулитах, ВИЧ-инфекции, аутоиммунном гепатите, болезни Крона идр. Увеличение содержания ЦИК у больных ревматоидным артритом говорит оразвитии системного ревматического процесса. Чаще всего для определенияуровня ЦИК применяют метод селективной преципитации полиэтиленгликолем.Однако,учитываягетерогенностьЦИК,дляегоопределенияследуетодновременно применять несколько методов, причем наилучшим считается методсвязывания ЦИК с Clq-компонентом комплемента. В процессе определения какЦИК, так и иммуноглобулинов, при анализе полученных результатов следуетучитывать, что клиническое значение имеет только повышение их содержания вкратное число раз (в 2, 3 раза и более).Для более глубокого и всестороннего изучения иммунологических реакцийобычно проводят более детальное изучение иммунных комплексов и системыкомплемента.Показания к назначению анализа на ЦИК в клинической лабораторнойпрактике:- диагностика и мониторинг аутоиммунных заболеваний;- диагностика и мониторинг хронических инфекционных заболеваний;- мониторинг хронических воспалительных заболеваний почек;-вкомплексесдругимиисследованиямидлядиагностикииммунодефицитных состояний.Оборудование и материалы:- фотометр вертикального сканирования, который позволяет измерятьоптическую плотность содержимого лунок планшета при длине волны 450 нм;51- дозаторы со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемыв диапазоне 20-250 мкл;- перчатки резиновые или пластиковые.Проведение анализа1.
Приготовление планшета.Вскрыть пакет с планшетом и установить на рамку необходимое количествострипов. Оставшиеся неиспользованными стрипы хранить в течение всего срокагодности набора при температуре +2…+25 С.Поместить в рамку необходимое количество стрипов – исследуемыеобразцы в 4 повторах и 4 лунки для контроля Буфера для разведения (А1, А2, В1,В2).2. Внести Пурпурный Буфер для разведения – 200мкл в нечетные (1,3,5..)стрипы планшета.Внести Синий Буфер для разведения с 4,5% ПЭГ – 200 мклв четные (2, 4,6…) стрипы планшета.3.
Внести по 20 мкл исследуемых образцов в 4 повторах в соответствии сосхемойABCDEFGH1#1#1#2#2#3#34.2345#4 #4 …#4 #4 …#1 #5 #5 …#1 #5 #5 …#2 #6 #6 …#2 #6 #6 …#3 #7 #7 …#3 #7 #7 …Заклеить планшет бумагой для заклеивания планшета. Инкубироватьпланшет при температуре +18…+25С в течение 120 минут.5.Измерить на фотометре вертикального сканирования при длине волны450 нм величину оптической плотности (ОП) содержимого лунок планшета.Выставить по лункам контроля Буфера для разведения бланк фотометра52(например А1). ОП контроля Буфера для разведения не должно превышать 0.07оптических единиц.6.Рассчитать единицы ЦИК.
(ОП образца N с Синим Буфером дляразведения) МИНУС (ОП образца N с Пурпурным Буфером для разведения).Разницу УМНОЖИТЬ на 1000 +Единицы ЦИК.Иммунологическое обследование было стандартизованным для всехклинических вариантов рассеянного склероза. У пациентов на проточномцитофлуориметре HAVIOS Beckman Coulter, с помощью моноклональных антителCYTO-STATtetraCHROM идентифицировали клоны и субклоны лимфоцитов; также методом проточной цитометрии характеризовали поглотительную способностьфагоцитов – фагоцитарного показателя и числа. Оценку кислородзависимогометаболизма нейтрофилов осуществляли тестом с нитросиним тетразолием – НСТспонтанным и НСТ активированным, соответственно, свидетельствующихоперативную и резервную способность фагоцитов.
Определение в сывороткесодержания циркулирующих иммунных комплексов – теста на наличиеаутоагрессивных процессов в организме, реализовали спектрофотометрически поHaskova с полиэтиленгликолем. Определение иммунных глобулинов основныхтрех классов осуществляли турбодиметрическим методом на биохимическоманализаторе Chospitec, (Голландия). Определение про- и противовоспалительныхцитокинов (интерлейкинов 4, 6, 8, факторов некроза опухолей альфа) –иммуноферментным методом на наборах фирмы «Протеиновый контур». Так же упациентовсовсеминозоформамирассеянногосклерозаиспользовалистандартизованные гематологические, иммунологические методы и конкретныепри отдельных нозоформах – биохимические, клинические и гистохимическиепараметры.Для оценки гематологических маркеров воспаления у больных, страдающихвсеми вариантами заболеваний, использовали стандартные лабораторные методыопределения содержания – лейкоцитов, лимфоцитов, нейтрофилов, эозинофилов,моноцитов, СОЭ.532.4.
Методы статистического анализа полученных данныхОсновнымлабораторногопринципоммониторингаобеспеченияпациентовконтролируемогоявляетсястандартизацияклиникосроковобследования; формирование адекватной группы сравнения – здоровых лиц,пациентов; использование панели современных клинико-лабораторных методов,методов математического анализа результатов и т.д.;Использование математической обработки материалов реализовали внесколько этапов.На первом этапе (стадия планирования наблюдений и первичного анализарезультатов) выполнялась рандомизация пациентов по возрасту, полу, тяжестиболезни и др. Для определения репрезентативности выборки и расчета требуемогодля получения объективных выводов числа больных в группе использоваласьследующая формула:n= +2212( M 1 − M 2) 2где величины М1 и М2 – средние значения показателей в группе, 1 и 1 – средниеквадратические отклонения соответствующих показателей [15].Перед статистическим анализом выявляли нормальность распределенияпоказателей по критерию Колмогорова-Смирнова и коэффициенту вариации и сучетом этого выбирали статистические критерии достоверности различий –параметрический, Стьюдента или непараметрический, Вилкоксона-Манна-Уитни[15].Для нивелирования возможных ошибок определяли и исключали из анализавыскакивающие значения лабораторных параметров из цифровых рядов по Иетсу[44].Динамикупараметровхарактеризовалитакжечастотнымирезультирующим частотным анализами, выявляющих основную тенденцию54вариаций лабораторных параметров от заданного уровня.На втором этапе оценивали общие количественные изменения слагаемыхиммуно-лабораторногостатусамобильнымэффектом,характеризующимосновную тенденцию вариаций (по достоверной динамике средних величинпараметров от исходного уровня), частотным при выявлении количества (%)пациентов, в группе с значимой, II, III степенью иммунных расстройств поконкретным показателям иммунограмм, результирующим частотным (при оценкеитоговой, преобладающей динамики параметров в сторону стимуляции илисупрессии), графическим анализами [49, 50].
Графический анализ использовалсядля наглядной оценки (визуализации) изменений иммунного статуса пациентов.Использовался следующий подход: 1) строилась лепестковая диаграмма, вкоторой по диаметрам откладывались нормированные в заданном масштабезначения лабораторных показателей здоровых лиц, которые в результатеобразовали окружность определенного диаметра; 2) также по диаметрамдиаграммы в виде отдельных точек обозначались в определенном масштабесредние значения параметров пациентов из исследуемых отдельных групп; 3)соединения обозначенных точек формирует ломаную кривую, представляющуюсобой иммунный профиль.На третьем этапе характеризовали качественные вариации иммунногостатуса путем расчета степени иммунологических расстройств отдельныхпоказателей по формуле: показатель больного −1 100% . показатель здоровогоДля интерпретации полученных результатов использовалась следующаяшкала:- менее 33 % - I степень иммунных расстройств (незначимые изменения);- от 34 до 66% - II степень иммунных расстройств (значимые изменения);- выше 66% - III степень иммунных расстройств (выраженные изменения).При наличии знака «–» иммунные расстройства характеризовались как55иммунологическая недостаточность (ИН), а знака «+» – как гиперфункцияиммунной системы (ГИС).Далеенаосновестандартных статистических критериеввыделялипоказатели, достоверно отличающиеся от заданного уровня и выявлялисигнальные показатели на основе коэффициента диагностической ценности (Кj),рассчитываемого по формуле (А.Л.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
