Автореферат (1154857), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Работа иллюстрирована 14 рисунками и 22 таблицами.Библиографический список содержит 201 литературный источник, из них 50отечественных и 151 зарубежный.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯЭкспериментальная работа выполнена на 90 белых нелинейных крысахсамцах, массой 180-220 г. Все исследования проведены в соответствии спринципами биоэтики, регламентируемыми действующим законодательствомРФ и международными конвенциями по защите лабораторных животных.Животные были разделены на 3 группы по 10 особей в каждой:1-я группа сравнения,включалаложнооперированныхживотных;2-я группа отрицательный контроль включала экспериментальных животных,которым имплантировали скаффолд на основе ПКЛ с адсорбированным на немчужероднымбелком(скаффолд,заведомонеобладающийбиосовместимостью).
В 3-й основной группе животным выполняли подкожнуюимплантацию скаффолда на основе ПКЛ и ГА.10Всем животным за 5 минут до проведения манипуляций вводиливнутримышечно комбинацию золетила («Virbac Sante Animale», Франция) вдозе 0,1 мл/кг и ксилазина («Interchemie», Нидерланды) в дозе 1 мг/кг длядостижения наркоза.Для имплантации использовали оригинальные скаффолды на основе ПКЛи ГА, разработанные и изготовленные в отделе электроформованияОбразовательно-научного института наноструктур и биосистем ФГБОУ ВПО«Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского»Минобрнауки России. Состав скаффолда включал ПКЛ – 95% и ГА – 5%.Средний диаметр волокон скаффолдов – 150-200 нм, пористость – не менее90%, поверхностная плотность ~2 г/кв.м.Скаффолды в форме диска диаметром 15 мм, толщиной 0,1 ммимплантировали экспериментальным животным в подкожную клетчаткумежлопаточной области по методике, изложенной в работе (Dorj et al., 2013).Динамику изменения микроциркуляции исследовали методом (ЛДФ) спомощью анализатора «ЛАКК-ОП» (производство НПП «Лазма», Россия).Регистрация ЛДФ-грамм осуществлялась на 7-й, 14-й и 21-й день эксперимента.В качестве контроля использовали ЛДФ-граммы, зарегистрированные уживотных до оперативного вмешательства (интактные животные).Световодный зонд фиксировали на коже над областью имплантациискаффолда.
Проводилось определение показателя перфузии (М) вперфузионных единицах (пф. ед.). С помощью вейвлет-анализа оценивалосьсостояние активных механизмов модуляции кровотока по величиненормированных амплитуд эндотелиальных (0,01–0,076 Гц), нейрогенных(0,076–0,2 Гц) и миогенных (0,2–0,74 Гц) осцилляций микроциркуляции.С целью оценки воспалительных изменений и динамики заселения матрицклетками соединительной ткани проводили исследование препаратов мягкихтканей зоны имплантации скаффолда или же области имитации имплантации.Выведение животных из опыта осуществляли путем декапитации по 10 особейиз каждой группы на 7, 14 и 21 сутки эксперимента.
Срезы толщиной 5-7 мкмокрашивали гематоксилином Майера и эозином (ООО «Биовитрум», Россия).Исследование микропрепаратов проводили при помощи микроскопаAxioImager Z2 (производство CarlZeiss, Германия). При оценке динамикисостава клеточной популяции скаффолда проводили подсчет количества11фибробластов, фиброцитов, нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов имакрофагов в поле зрения при увеличении 400.Определение концентрации эндотелиального фактора роста (VEGF)проводили в сыворотке крови на микропланшетном спектрофотометре«EpochBioTekInstruments»(США)методомтвердофазногоиммуноферментного анализа с использованием набора реактивов «VEGF Rat»фирмы RnD Systems (США).Определение концентрации С-реактивного белка (СРБ) проводили всыворотке крови иммунотурбидиметрическим тестом DiaSys Diagnostic SystemsGmbH (Германия) с помощью анализатора Sapphire-350 (Ирландия).Активность церулоплазмина (ЦП) определялась по степени окисленияраствора пара-фенилендиамина в сыворотке крови модифицированнымметодом Ревина и выражалась в условных единицах (Пишак В.П.
и соавт.,1998).Статистическую обработку полученных данных осуществляли припомощи пакета программ Statistica 10.0. Проверяли гипотезы о видераспределений (критерий Шапиро-Уилкса). Большинство наших данных несоответствуют закону нормального распределения, поэтому для сравнениязначений использовался U-критерий Манна-Уитни, на основании которогорассчитывался Z – критерий Фишера и показатель достоверности p.РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕМестные и системные реакции организма в ответ на хирургическуютравматизацию мягких тканей, имитирующую имплантацию скаффолдаПолученные данные свидетельствуют, что у животных группы сравнения(ложнооперированные животные) оперативное вмешательство вызываетумеренные транзиторные изменения локального кровотока, которые наиболеевыражены на 7-е сутки, что проявляется увеличением перфузионногопоказателя в среднем на 27%, и полностью исчезают к 21-м суткамэксперимента.
Изменения активных механизмов модуляции микроциркуляциипроявляются увеличением абсолютных значений амплитуд нейрогенных имиогенных колебаний, которые полностью нормализуются на 14-е суткиэксперимента.При морфологическом исследовании зоны имитации имплантациискаффолдов обнаружены локальные транзиторные сосудистые и тканевые12реакции, характерные для процесса асептического воспаления: отек подкожнойжировой клетчатки, инфильтрация единичными лейкоцитами. Однако так же,как и сдвиги перфузии кожи над областью имплантации, локальныевоспалительные изменения достигают максимального развития на 7-е суткиэксперимента и полностью исчезают к 21-м суткам.Оперативное вмешательство в объеме имплантации скаффолда вызываетувеличение концентрации в сыворотке крови СРБ и ЦП на 7-е сутки послеоперативного вмешательства.
К 14-м суткам эксперимента содержание белковострой фазы в крови полностью нормализуются.Таким образом, оперативное вмешательство в объеме, соответствующемимплантации скаффолда, вызывает умеренные локальные сосудистые итканевые реакции, характеризующиеся повышением перфузии кожи, отеком илейкоцитарной инфильтрацией подкожной жировой клетчатки, а такжеувеличением концентрации белков острой фазы воспаления в крови. Данныеизменения, обусловленные травматизацией тканей, наиболее выражены на 7-есутки и полностью нивелируются к 21-м суткам эксперимента.Местные и системные реакции организма при субкутаннойимплантации скаффолдов, не обладающих биосовместимостьюВ результате проведенных исследований обнаружено, что на 7-е суткиэксперимента над областью имплантации скаффолда, содержащегочужеродный белок (группа отрицательного контроля), происходитзначительное (на 80% контрольной величины) увеличение перфузионногопоказателя кожи (рис. 1).
В отличие от группы сравнения у животных группыотрицательного контроля выраженная и стойкая гиперемия зарегистрирована впериод с 7-х по 21-е сутки (рис. 1).Рис. 1. Изменения показателя перфузии кожи в области имплантациискаффолдов у экспериментальных животныхПримечание: - различия статистически значимы по сравнению с контролем (р < 0,05)13Повышение показателя перфузии в данной группе животныхсопровождается увеличением амплитуд нейрогенных и миогенных осцилляциймикроциркуляции кожи. При этом снижение нейрогенного тонуса сосудоввариабельно, а миогенного – регистрируются в период с 7-х по 21-е суткиэксперимента (рис.
2).Рис. 2. Изменения активных механизмов модуляции микроциркуляциикожи в области имплантации скаффолдов у экспериментальных животных(амплитуда активных механизмов модуляции микроциркуляции, повертикальной оси - условные единицы).Примечание: -различия статистически значимы по сравнению с контролем (р < 0,05)Следовательно, стойкое повышение перфузии кожи над зонойимплантации скаффолда с адсорбированным чужеродным белком реализуетсяпреимущественно за счет снижения миогенного тонуса микрососудов, чтопозволяет выделить увеличение перфузионного показателя и амплитудымиогенных колебаний в качестве критериев отсутствия биосовместимости.В ходе морфологического исследования обнаружено, что через 7 сутокпосле имплантации скаффолда с адсорбированным на нем чужеродным белкомнаблюдаетсявыраженнаявоспалительнаяреакция,проявляющаясяполнокровием сосудов микроциркуляции, отеком и лейкоцитарнойинфильтрацией тканей на границе с имплантатом.
В период с 14-х по 21-е суткивоспаление переходит в пролиферативную фазу, что сопровождаетсяформированием вокруг имплантированного скаффолда соединительнотканногобарьера с неравномерно кровенаполненными сосудами, инфильтрированного14клетками лейкоцитарного ряда, среди которых присутствуют макрофаги,моноциты, лимфоциты и плазматические клетки. Клеточный состав скаффолдау животных данной группы на всех сроках наблюдения представленпреимущественно лейкоцитами: нейтрофилами, лимфоцитами и макрофагами(рис. 3).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
