Автореферат (1154514), страница 4
Текст из файла (страница 4)
coli №№ 7, 17, 22 характеризовались какнизкоадгезивные, а штаммы E. coli №№ 3, 13, 14, 27, 38, 39, 41 – каксреднеадгезивные. Все исследованные клинические штаммы, имеющие всоставе генома ген fimH, обладали высокой адгезивной активностью,поскольку значения ИАМ составляли от 4,28 до 7,22 (U критерий Манна–Уитни = 0; р = 0,000157).Таким образом, установлены достоверные отличия адгезивной активностиE.
coli в зависимости от наличия гена fimH.16Динамика формирования микробных биопленок штаммамиуропатогенных E. coliПроцесс формирования микробных биопленок моделировали в условиях invitro в лунках иммунологических планшетов в стационарных условиях.Было установлено, что значения, полученные во все периодыкультивирования микробных биопленок условно-патогенных микроорганизмов,достоверно превышали кoнтрольные показатели. Путем множественногосравнения выборок с попарно связанными вариантами установленыдостоверные отличия между штаммами по ранговому дисперсионному анализуФридмана (χ2 = 6,5; p < 0,05).Показано, что эталонный штамм E. coli АТСС 25922 увеличивал своюбиомассу через 24 часа культивирования в 8,78 раз по сравнению с контролем,через 48 часов происходило достоверное увеличение связывания красителя в1,4 раза по сравнению с показателями первых суток, через 72 часа – в 2,1 раза споследующим снижением к 4-м суткам в 1,28 раз (рис. 8).
Величинаинтенсивности пленкообразования клиническим штаммом E. coli № 7 на 1-есутки культивирования характеризовалась увеличением прироста биомассы в10,18 раз по сравнению с контролем.E.coli ATCC25922E.coli № 7 (fimH-)E.coli № 92 (fimH+)Рисунок 8 – Динамика величин связывания кристаллического фиолетовогомикробными биопленками, образованными эталонным и клиническимиштаммами E. coliНа вторые сутки культивирования наблюдалось незначительноеувеличение интенсивности связывания красителя в 1,17 раза по сравнению спредыдущими. На третьи сутки культивирования микробных биопленокпроисходило дальнейшее нарастание биомассы данного штамма и увеличениеинтенсивности связывания кристаллического фиолетового в 1,81 по сравнениюс предыдущими сутками, однако на четвертые сутки культивированияпроисходило снижение в 1,34 раза, как и при культивировании эталонногоштамма E.
coli АТСС 25922. Аналогичные результаты были получены прикультивировании клинического штамма E. coli № 92, несущего ген fimH:17через 24 часа культивирования наблюдалось увеличение интенсивностисвязывания кристаллического фиолетового в 11,8 раза по сравнению сконтролем, через 48 часов – в 1,37 раза по сравнению с предыдущими сутками,через 72 часа – в 1,66 раза с последующем снижением прироста биомассы через96 часов в 1,21 раза.Линейная динамика накопления красителя биопленками как эталонного,так и клинических штаммов E.
coli с первых по третьи сутки культивирования,вероятно, связана с последовательными стадиями ее созревания идифференцировки, поскольку в этот период микробные клеткихарактеризуются продукцией неспецифических факторов адгезии и высокойметаболической активностью.Снижение интенсивности связывания красителя через 96 часовкультивирования соответствует стадии дисперсии микробных биопленок E. coliввиду дефицита питательных веществ при стационарном способекультивировании в условиях in vitro.Согласно полученным результатам, наибольшая интенсивность связываниякрасителя всеми исследуемыми штаммами бактерий отмечалась через 24 часакультивирования.Кроме того, установлено, что для клинического штамма E.
coli № 92,несущего ген fimH, эта способность была достоверно выше по сравнению спленкообразующей способностью эталонного штамма E. coli АТСС 25922 в1,34 раза и клинического штамма E. coli № 7 в 1,16 раза, у которых данный генне был обнаружен.Таким образом, в ходе проведенных исследований методомспектрофотометрии было установлено, что как эталонный, так и клиническиештаммы E. coli способны формировать микробные биопленки в условияхin vitro, однако большая интенсивность пленкообразования характерна дляклинического штамма E. coli № 92, несущего ген fimH, который кодируетфакторы адгезии – пили I типа.Исследования морфологических особенностей модели микробнойбиопленки E. coli на поверхности изделий медицинского назначенияПоскольку процесс неспецифической адгезии микроорганизмов иначальные этапы формирования микробных биопленок in vitro происходят впервые сутки культивирования, представляло интерес оценить интенсивностьпленкообразования клинических штаммов E.
coli, отличающихся по наличиюгена fimH. Процесс формирования микробных биопленок моделировали наповерхности изделий медицинского назначения, в качестве которыхиспользовали уретральный катетер, изготовленный из полиуретана. Фрагментыкатетера помещали в пробирки с мясо-пептонным бульоном, содержащимсуточные культуры исследуемых микроорганизмов в концентрации 2×10 5м.к./мл. После экспозиции в течение 24 часов при 37°С полученные образцыинактивировали в 96%–ном этаноле и готовили препараты для электронномикроскопического исследования.18Оценка особенностей пленкообразования клиническим штаммом E.
coli№ 7, у которого отсутствовал ген fimH, позволила установить, что через 24 часакультивирования на поверхности фрагментов уретрального катетерапроисходил процесс адгезии бактерий: отмечались изолированные скоплениямикробных клеток, расположенные в один или два слоя, объединенныеэкзополимерным матриксом, количество которого было незначительным(рис. 9, А).2А12БРисунок 9 – Электронная микрофотография микробной биопленки клиническихштаммов E. coli: А – E. coli № 7 (fimH -), Б – E.
coli № 92 (fimH +)(1 – каналы микробной биопленки, 2 – структуры экзополимерного матрикса)При формировании биопленки штаммом E. coli № 92, несущим ген fimH,через сутки культивирования вся поверхность образца была покрытамногослойной микробной биопленкой, клетки в которой были либонепосредственно связаны между собой, либо их контакт осуществлялся черезкомпоненты экзополимерного матрикса (рис. 9, Б).
Одни участки биопленкиимели ровную поверхность благодаря микробным клеткам, лишеннымматрикса, другие клетки были связаны с экзополимерным матриксом,благодаря чему их поверхность имела неструктурированный вид. Всяповерхность биопленки была пронизана многочисленными каналами.Активный процесс формирования микробных биопленок на изделияхмедицинского назначения связан с отсутствием специфических защитныхпротивоинфекционных механизмов на инертных поверхностях искусственных19материалов катетеров, дренажей, протезов и др.
Это и объясняет формированиебактерионосительства при проведении медицинских манипуляций, а такжехронизации инфекционного процесса.Использование метода сканирующей электронной микроскопии позволилоустановить структурные особенности микробных биопленок, образованныхклиническими штаммами E. coli, отличающимися по наличию гена fimH.Таким образом, проведенные нами исследования позволили установить,что большинство выделенных штаммов условно-патогенных бактерий,вызывающих ИМП, характеризовались множественной резистентностью кантимикробным препаратам, которая у клинических штаммов E. coli былаобусловлена наличием генов ctx-m и aac(3)-II. Ген fimH, обнаруженный убольшинства клинических штаммов E.
coli, определял их высокий адгезивныйуровень, а также обуславливал интенсивный процесс пленкообразования вусловиях in vitro как в лунках иммунологического планшета, так и наповерхности образцов уретрального катетера.Выводы1. Из 200 штаммов бактерий, выделенных от пациентов Багдадскогоучебного госпиталя, в 92,5% возбудителями ИМП являлись представителисемейства Enterobacteriaceae, из которых 55,5% (111 штаммов) былиуропатогенные E.
coli, 14% (28 штаммов) – Klebsiella spp., 11,5% (23 штамма) –Enterobacter spp., 10% (20 штаммов) – Proteus spp. 1,5% (3 штамма) –Morganella morganii. Уропатогенные бактерии выделялись с большей частотойв возрастной группе 27–36 лет (27,5%), а ИМП регистрировались чаще уженщин (57,5%).2. Большинство (59,3%) выделенных штаммов уропатогенных бактерийхарактеризовались высоким уровнем устойчивости к антибиотикам иантимикробным химиотерапевтическим препаратам, однако все быличувствительны к имипенему и амикацину. Методом «двойных дисков»доказано наличие БЛРС у 51,4% клинических штаммов уропатогенных E. coli.3. Оценка генетических детерминант устойчивости бактерий сиспользованием ПЦР позволила установить наличие гена ctx-m у 63% штаммовE. coli, для которых предварительно было показано наличие БЛРСфенотипическим методом, и гена aac(3)-II у 78,2% исследуемых штаммовуропатогенных E.
coli, устойчивых к тобрамицину и гентамицину.4. Доказано наличие гена fimH, детерминирующего синтез пилей I типа, у63% клинических штаммов уропатогенных E. coli; штаммы, имеющие данныйген, по показателю индекса адгезии микроорганизмов характеризовались каквысокоадгезивные (ИАМ составил 4,28 – 7,22).5. Наличие гена fimH обеспечивает уропатогенным E. coli болееинтенсивный процесс формирования микробных биопленок на инертныхповерхностях лунок иммунологических планшетов и образцах полиуретановыхуретральных катетеров по сравнению с эталонным штаммом E. coli АТСС25922 и клиническими штаммами, не имеющими данного гена.20Список работ, опубликованных по теме диссертацииПубликации в журналах из списка рекомендованных ВАК РФ:1.
Glinskaya E. V., Al-Bayati B. M., Nechaeva O. V., Luneva I. O. Antibioticsusceptibility of pathogens in urinary tract infections in community // ИзвестияСаратовского университета. Новая серия. Серия «Химия. Биология. Экология». –2015. – Том 15, Выпуск 4. – С. 63–66.2. Al-Bayati B. M., Glinskaya E. V., Nechaeva O. V., Luneva I. O. Genotypicdetection of fimH virulence gene in uropathogenic E.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
