Диссертация (1154491), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Метод биопсии трофоэктодермы и обработка материала длягенетического анализаДля биопсии трофоэктодермы применялась инновационная лазернаятехнология (хэтчинг), т.к. лазер без вреда для эмбриона разрезает оболочкуэмбриона (зону пеллюцида), а также используется для быстрого отжиганиябиопсированного материала.Биопсия трофоэктодермыХэтчинг выполняется на 3-й или 4-й день.
Разрез должен быть меньше, чемдля биопсии бластомеров. Биопсия производится на 5-й день (3-5 клеток). Видеале бластоциста должна начинать вылупляться.Процедураподготовкигенетическогоматериалаосуществляетсявстерильном боксе.Маркировка образцов для генетического скрининга1. В стерильном боксе подготавливается необходимое количество чашек Петрииз расчета 1 чашка на 1 клетку.2.Метятся чашки с указанием номера эмбриона и номера клетки.3.Наносятся 3 капли (15-20 мкл) буфера.Протокол отмывки1.
Емкость с отобранными клетками помещается под микроскоп.2. Забирается клетка в минимальном объеме жидкости и помещается в каплю1.3. Капилляр перемещается в другую область той же капли и удаляютсяостатки жидкости. Капилляр перемещается в третью область, отбираетсянебольшой объем жидкости. Забирается клетка и перемещается во вторуюкаплю.4. Шаги, описанные в пункте 3, повторяются в капле 2 PBS-ПВП(Поливинилпиролидола).585.
Отбирается клетка в капле 2 в минимальном объеме буфера PBS-ПВП.Необходимо убедиться, что клетка не находится слишком близко к концукапилляра или рядом с мениском.6. Капилляр помещается в микропробирку без соприкосновения со стенками.7. Необходимоубедиться,чтокапиллярпомещенвбуфернаднемикропробирки.8. Клетка помещается в объеме не более 0,2 мкл. Капилляр удаляется,пробирки помещаются в охлажденный штатив.9.
Для отбора отрицательного контроля используется новый стерильныйкапилляр. Нужно вернуться к капле 3, отобрать небольшой объем буфераPBS-ПВП и поместить его в соответствующую микропробирку.10. Капилляр удаляется. Если клетки будут подвергаться анализу в течение 24часов, нужно оставить их при 4°C, в другом случае клетки замораживаются.Протокол витрификации эмбрионовРасходные материалы и среды Уравновешивающий раствор (ES) 1х1,5 мл Витрификационный раствор (VS1 и VS2) 1х1,5 мл Четыре криотопа (один криотоп вмещает 4 эмбриона) Два 6-луночных планшета Полистироловый бокс для охлаждения в жидком азоте Пастеровская пипетка Бинокулярная лупа без подогрева Секундомер Жидкий азот Пинцет Два микросамплера 2-20 мкл и 100-1000 мкл. Канистра59Последовательность операций1.Подогреть растворы до комнатной температуры.2.Написать на криотопе фамилию пациентки, номер карты, дату заморозки(рис.4).3.Наполнить жидким азотом пенопластовый бокс.4.Взять чашки с материалом для замораживания из инкубатора.
Проверитькачество эмбрионов под микроскопом.5.Маркировать лунки с растворами как ES, VS1 и VS2. Добавить самплеромES 300 мкл,VS1 300 мкл и VS2 300 мкл. Накрыть крышкой.6.Начало эквилибровки эмбрионов. Перенести эмбрионы в минимальномобъеме в раствор ES, выпустить у поверхности и оставить на 9-12 минут.Эквилибрация закончена, когда ширина перивителлинового пространства станетравнойтой,котораябылапереддобавкойраствораES.Ширинаперивителлинового пространства должна приблизительно равняться толщинеZona Pellucida.7.С этого момента и далее процедура должна быть закончена в течение 60 - 90секунд.8.Поместить эмбрион в начало стриппера и перенести к средине глубиныVS1в минимальном объеме ES.
Отмыть эмбрион от ES в VS1, промыть пипетку 2 разав VS1 (30-40 секунд).9.Перенести эмбрион с помощью стриппера, предварительно промытого врастворе VS2, из VS1 вVS2 в минимальном объеме раствора (10-20 секунд).10.Настроить фокус микроскопа на поверхность криотоповской пластинкивозле черной отметки (ЛОГО вверх, рис.1).11.Перенести эмбрионы на поверхность криотоповской пластинки и убратьмаксимальный объем VS2, оставив эмбрионы в минимальном объеме VS2.12.Перенести криотоп в пенопластовый контейнер с жидким азотом.13.Перенести замороженный материал в криохранилище для хранения вжидком азоте.60Рис.
7. Схематический рисунок крионосителя (криотоп) с эмбрионом послебиопсии2.2.6.Метод сравнительной геномной гибридизации с использованиемолигонуклеотидных микрочипов и суммарной геномной ДНКМетод СГГ представляет собой гибридизацию меченных двумя разнымифлуоресцентнымикрасителямифрагментированныхмолекулДНКизисследуемого и контрольного образцов. Наличие делеции в исследуемомматериале приведет к тому, что аналогичные фрагменты ДНК контрольногообразца будут присутствовать в избытке, что отразится на интенсивностифлуоресцентного сигнала при дальнейшей гибридизации на метафазныхпластинках.
Наличие же дупликации приведет к противоположной картине насоответствующем участке: будет наблюдаться увеличение флуоресцентногосигнала другого цвета [du Manoir S. et al.,1993, Екимова Е. В. и др., 2012].СГГ на биологических чипах позволяет определить различные нарушениякариотипа:анеуплоидии,микродупликационныеперестройки.Вместетранслокации,синдромы,стем,микроделеционныенесбалансированныеданныйметоднеисубтеломерныепозволяетвыявлятьсбалансированные перестройки (реципрокные транслокации, робертсоновскиетранслокации,инверсии,реципрокныеинсерции)инесбалансированныеперестройки, находящиеся за границей разрешения [Глинкина Ж.И. и др., 2014].Сравнительная геномная гибридизация генетического материала эмбрионавыполняласьсиспользованиемоборудованияфирмыAgilent(США).Полногеномную амплификацию ДНК исследуемых клеток проводили с помощьюнабора PicoPlex SingleCell WGA Kit (Rubicon Genomics, США).
Качество иколичество полученной в ходе амплификации ДНК контролировали с помощью61электрофореза в 1,2% агарозном геле. Мечение ампликонов проводили сиспользованием набора SureTag DNA labeling Kit Agilent (США) согласноприлагаемой инструкции. Меченые ампликоны наносили на биочип Sure Print G38x60 KCGH Agilent (США), гибридизировали 16 часов, после чего проводилиотмывкуисканированиенасканеребиологическихчиповSureScanMicroarrayScanner.Рис.
8. Схема осуществления технологии СГГ (из источника Philippe Hupé Emmanuel Barillot et al., 2012)Интерпретациюполученныхрезультатовосуществлялиспомощьюпрограммного продукта Agilent CytoGenomics 2.5.8.1.Показатели, анализируемые в ходе представленного исследования: Наличие трисомии по аутосомам Наличие моносомии по аутосомам Наличие трисомии по половым хромосомам62 Наличие моносомии по половым хромосомам Наличие делеций и амплификаций2.2.7. Статистическая обработка результатов исследования.Вседанныепопредимплантационномугенетическомускринингусистематизировались в таблице MS Excel. В работе рассматривались только парыс количеством диагностированных эмбрионов более 1.
Для сравнения средних вгруппах применяли модификацию t-теста Стьюдента для наблюдений с весами[Goldberg L. et al., 2005], реализованную в пакете «R language» [R Core Team,2016]. В качестве весов использовали число биопсированных эмбрионов. Дляподтверждения полученных результатов также применяли непараметрическийкритерий Манна-Уитни-Уилкоксона, рассчитанный с помощью программыStatistica 6.0 [Mann H. et al., 2008].63ГЛАВА 3РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕВ мировой практике нет единого мнения о влиянии женского и мужскогогенетического материала на хромосомный набор эмбриона. В некоторых работахсообщается,чтогенетическийматериаляйцеклеткисвязанс60-80%хромосомных аберраций, обнаруживаемых в эмбрионах [Gianaroli L.
et al., 1999;Gianaroli L. et al., 2001; Munné S. et al., 2007], в то же время, аномальная сперма свысокими частотами анеуплоидий может быть связана с 62% хромосомныхошибок, возникающих в эмбрионах [Magli C. et al., 2009]. Результатыпроведенной работы позволяют более определенно предполагать наличиезначимогоотцовскоговкладавнаблюдаемоеповышенноеколичествоанеуплоидий в эмбрионах, полученных в парах с различными отклонениями впоказателях спермограммы, а также с повышенным уровнем фрагментации ДНКсперматозоидов.В представленной главе рассмотрим поочередно все функциональныепоказатели сперматозоидов отца и их влияние на кариотип полученныхэмбрионов.3.1.Концентрация сперматозоидовПри изучении ассоциации концентрации сперматозоидов с кариотипомполучаемых эмбрионов рассматривались 2 подгруппы: у мужчин однойподгруппы содержание сперматозоидов было более 15 млн.
в одном миллилитреэякулята, что по современным критериям ВОЗ рассматривается в качестве нормы,а у мужчин другой подгруппы – менее 15 млн/мл (патология).Результаты, полученные в общей группе исследуемых, представлены втаблице 1.64Таблица 1. Частота (%) аномалий числа и структуры хромосом у эмбрионовв парах с нормальной и патологической концентрацией сперматозоидов (общаягруппа исследуемых пар)Концентрациясперматозоидовв эякулятеКариотип эмбрионовМенееБолее1515млн/млмлн/млpМУУ-(n=41)(n=92)t-тесттестрНормальный47.3147.770.94490.6911Трисомии по аутосомам32.7133.820.84450.7908Моносомии по аутосомам32.1433.690.78870.6087хромосомам3.275.110.33290.6483Делеции и амплификации16.3511.950.37080.6587ТрисомиипополовымКак видно из представленных данных, в сравниваемых подгруппахнормальныйкариотипнаблюдаетсяприблизительноу47%эмбрионов.Встречаемость численных аномалий аутосом, трисомий по половым хромосомамтак же, как делеций и амплификаций,в данных подгруппах достоверно неотличается.65Аналогичные результаты были получены в группе репродуктивноговозраста (табл.
2).Таблица 2. Частота (%) аномалий числа и структуры хромосом у эмбрионовв парах с нормальной и патологической концентрацией сперматозоидов (группарепродуктивного возраста)Концентрациясперматозоидов вэякулятеМенееБолее1515млн/млмлн/млpМУУ-(n=30)(n=63)t-тесттестНормальный53.4757.810.6170.8292Трисомии по аутосомам27.8524.360.61720.5578Моносомии по аутосомам23.8626.740.63790.5596хромосомам3.744.610.74370.9385Делеции и амплификации19.1713.580.38590.5913Кариотип эмбрионовТрисомиипорполовымВместе с тем, в группе репродуктивного возраста наблюдается выраженнаятенденция к увеличению частоты эмбрионов с нормальным кариотипом, что66особенно заметно в подгруппе с нормальной концентрацией сперматозоидов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
