Диссертация (1154488), страница 15

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 15)

Внекоторых случаях для определения длинны ампликонов больше 2000 п.н.применяли маркер длин с диапазоном от 250 до 10 000 п.н. (Gel Loading Dye,Evrogen). Кроме того, в каждом эксперименте использовали контрольныйобразец, свободный от ДНК и содержащий лишь смесь для ПЦР с нужнымпраймером. Продолжительность фореза составляла 1 час, напряжение – 80 В,кювету с буфером охлаждали. После завершения электрофореза геливыдерживали 20 минут в водном растворе этидия бромида. Результатыфиксировали с помощью системы гель-документации и производилиобработку результатов при помощи программы GelAnalysis.Полученныеизображенияобрабатывалиследующимобразом.Производили визуальный сравнительный подсчет ампликонов (полос) вкаждом образце.

Наличие ампликона обозначали как «1» (аллель p), а егоотсутствие - как «0» (аллель q). На основе полученного массива данныхстроили бинарную матрицу. В ходе анализа учитывали только четкопросматриваемые ампликоны. С использованием праймера UBS-809 намидиагностировано 18 локусов, с UBS-811 – 19 локусов, с UBS-827 - 20 локусов(рис. 3.7.).80АДлинап,н.БUBC809UBC81111UBC827130002500200018001600140012002000 пн1000900800700600500450400350300250200150250 пн19182010050Рис. 3.7. А – Фрагмент электрофореграммы с ДНК-паттернами H.pomatia, полученными с помощью праймера UBC 809.

Б — расшифровкаДНК-паттернов H. pomatia (номерами обозначены только первые ипоследние локусы).3.5. Метод ДНК-кометСтепеньустойчивостипопуляцийH.pomatiaкдействиюгенотоксичных ксенобиотиков среды определяли с помощью метода ДНКкомет щелочного гель-электрофореза изолированных клеток («comet assay»)(метод) который был впервые успешно применен в работе В. Rydberg и K. J.Johanson (Rydberg, Johanson, 1978). В несколько измененном виде, этот методактивно применяется в настоящее время для определения генотоксичностиразличных ксенобиотиков (Olive, Banath, 2006; Жанатаев и др., 2007; Collinset al., 2008; Dhawan, Anderson, 2009; Dhawanand et al., 2009). Кроме того, всебольше появляется работ, где данный метод применяется для оценкимутагенной нагрузки на природные популяции (Shugart, 2000; Regoli et al.,812004; Mitchelmore C.L. et al., 2004; Оганесян и др., 2012), в том числе и напопуляции моллюсков (Слободскова и др., 2011; Конева, 2013, Снегин, 2014).В наших исследованиях данный метод применялся для оценки степениразрушения ДНК в популяциях H.

pomatia, обитающих в г. Белгород и егоокрестностей (пункты «Белгород», «Майский», «Шопино», «Донец»).Для эксперимента в день его проведения из популяций отбирали по 10живых особей, при визуальном осмотре которых был выражен отворотперистома, так называемая губа на раковине, что свидетельствовало ополовозрелости исследуемого моллюска.

Для проведения анализа браликусочек ткани гепатопанкриеса. Далее гомогенизировали ткань до состоянияклеточной суспензии. Все манипуляции проводили при температуре +4ºС вфосфатно-солевом буфере (рН 7.5), с содержанием 20 mM EDTA-Na2 и 10%ДМСО. После центрифугирования осажденные клетки помещали в растворлегкоплавкой агарозы, затем переносили эту массу на предметные стекла,покрытые подложкой из агарозы, при температуре +42ºС (Снегин, Ненашева,Аремчук, 2014). Таким образом получали так называемые гель-слайды.Используемые для этого предметные стекла предварительно обезжиривалисмесью Никифорова, затем на них наносили тонкий слой расплавленнойагарозы. Лизис белковых компонентов клеток проводили в течение 2 часовпри температуре +4ºС в лизирующем буфере, состоящим из: 10 mM Tris-HCl(pH 10), 2.5 M NaCl, 100 mM EDTA-Na2, 1% Triton X-100 и 10% ДМСО.

Дляэтого в непрозрачную кювету наливали лизирующий раствор и погружали внего стекла так, чтобы над ними был слой буфера толщиной 2-3 мм.Накрывали кювету непрозрачной крышкой. Саму процедуру электрофорезапроводили в горизонтальной камере в темной комнате. В день экспериментаготовили Tris-EDTA-боратный буфер (pH 8,9). Электрофорез проводили втечение 20 минут, напряжение подбирали из расчета 1В/1см. По окончаниюэксперимента препараты фиксировали в 70% этаноле. Зафиксированныепрепараты высушивали и окрашивали при помощи водного растворакрасителя SYBR Creen I (в отношении 1:10000). Окрашенные гель-слайды82просматривалиианализировалиналюминисцентномбинокулярноммикроскопе МИКМЕД-2.

Сфотографированные ядра ранжировали по пятитипам в зависимости от степени разрушения ДНК (рис. 3.8.). На каждомисследуемом препарате учитывали не менее 100 ядер. В дальнейшемполученные данные использовали для расчета индекса ДНК-комет (Struwe etal., 2007):ИДК=(0n0+1n1+2n2+3n3+4n4)/∑,Где n0-n4- число «ДНК-комет» каждого из 5 условных типов, а ∑- общаясумма подсчитанных комет.Дополнительно, на каждом препарате мы учитывали также клетки,находящиеся в состоянии апоптоза.Рис.

3.8. Типы ДНК-«комет»: 0 - неразрешенное клеточное ядро, 1 первая стадия разрушения, 2 - вторая стадия разрушения,3 -третья стадияразрушения,4 - четвертая стадия разрушения.3.6. Методика статистической обработки полученных результатовСтатистическую обработку полученных данных проводили припомощи пакетов программ Statistica 6 (TL 835), GenAlEx (Peakall, Smouse,2001), PорGene 1.32 (Yeh et al., 2000), MEGA5 (Tamura et al., 2011). При этомиспользовали различные формулы, применяемые в популяционной экологиии популяционной генетике.Показатели внутрипопуляционного разнообразия (µ) и доли редкихморф (h) и индекс фенетического сходства (r) для популяций рассчитывалисьпо формулам, предложенным Л. А. Животовским (Животовский, 1979, 1991):  ( q1  q2  ...

 qm ) 2 , S    (m   ) / N83h  1  (  / m) , S h  h (1  h ) / Nгде µ - показатель внутрипопуляционного разнообразия, Sµ – ошибкапоказателя внутрипопуляционного разнообразия; h – показатель доли редкихморф и Sh его ошибка; q1, q2, qm- частоты соответствующих морф (m), N –объем выборки.Индекс фенетического сходства популяций рассчитывали по формуле:r  m1 n1  m2 n2  ...  mk nkгде r – показатель сходства фенетических структур популяций, mn –частоты общих для двух популяций морф, k – число общих для двухпопуляций фенов.Поскольку наследование аллелей изоферментных локусов проходит покодоминатному типу, расчет частот аллелей (например, для трех аллельноголокуса) проводили следующим образом:a2 N aa  N ab  N ac, где2Nа – частота аллеля в трехаллельном локусе.Nаа - количество аллеля а в гомозиготных генотипах,Nab и Naс - количество аллеля а в гетерозиготных генотипах,N - общее число аллелей анализируемого локуса в изучаемой группе.Полученное значение варьирует от 0 до 1.Доля полиморфных локусов P (Левонтин, 1978):LP=  xi lli,Lгде Р - доля полиморфных локусов, i - число полиморфных локусов ввыборке, L - число изученных локусов.Среднее число аллелей на локус (A):A1 L ni ,L i 1где ni – число всех аллелей по данному локусу, L – число изученныхлокусов.84Эффективное число аллелей Аe для каждого локуса:Аe =1,1  Heгде He –ожидаемая гетерозиготность.Средняя наблюдаемая гетерозиготность в популяции по каждомулокусу (Н0) (Wright, 1943):Ln1 i n iH0 ,L Niгде L – число изученных локусов, ni – число гетерозиготных особей поi-му аллелю.Допуская, что исследуемые нами популяции панмиктические, мыиспользовалиследующуюформулудлявычисленияожидаемойгетерозиготности (Не) (Wright, 1943):ni2He  1  p ,iLСредняя наблюдаемая гетерозиготность по всем локусам для отдельновзятой популяции ( Ho n) рассчитывалась как среднее арифметическое Ho покаждому локусу, разделенное на количество локусов.Ho n = ( Ho  ...

 Hoj )in, гдеHoi -средняя наблюдаемая гетерозиготность по локусу iHo j - средняя наблюдаемая гетерозиготность по локусу jn-количество локусов.Средняя ожидаемая гетерозиготность по всем локусам для популяциирассчитывалась как средняя арифметическая: сумма He по каждому локусу,разделенная на количество локусов: ( He  ...  Hej ) , гдеiHe n=nHei -средняя ожидаемая гетерозиготность по локусу i,85He j - средняя ожидаемая гетерозиготность по локусу j,n-количество локусов.Cтандартную ошибку для двух вышеуказанных средних He n и Ho nрассчитывали данном случае по формуле:SE=гдеsn,s-стандартноеотклонениеслучайнойвеличинынаосновенесмещённой оценки её выборочной дисперсии, n-объем выборки.Коэффициент инбридинга (Fixation index) (Wright, 1943):F  1ИнформационнаямераH0Heразнообразия(индексШеннона-Уивера)(MacArthur, 1955):I sh   pi ln pi ,где pi – частота i-аллеляИндекс Генетического сходства (Nei, 1972):I ai bi22 ai  bi,где ai и bi частоты аллелей в первой и во второй сравниваемыхпопуляцияхГенетическая дистанция (Nei, 1972):D   ln IДля того чтобы оценить уровень генетической дифференциацииисследуемых популяции мы использовали формулы, предложенные С.Райтом (Wright, 1943, 1951).1.

Коэффициент инбридинга особи относительно большой популяции(Fit):86Fit  N (Qii q2 )iNq(1  q)2. Коэффициент инбридинга особи относительно субпопуляции (Fis):Fis  N (Qii qi )2iNq(1  q)3. Коэффициент инбридинга субпопуляции относительно большойпопуляции (индекс подразделенности популяций) (Fst):Fst  N (qi qi )2iiNq(1  q)В приведенных выше формулах: N – численность большой популяции,Ni – численность субпопуляции, qi – частота гена а в субпопуляции, Qi –частота генотипа аа в субпопуляции , q – частота гена а в большойпопуляции.Интенсивность потока генов (Nm):Nm 1  1 14  Fst Помимо F статистики С.

Характеристики

Список файлов диссертации