Диссертация (1151325), страница 27
Текст из файла (страница 27)
ЗАКЛЮЧЕНИЕ3.1. Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕДанноедиссертационноеисследованиевыполненоврамкахмалоизученной темы взаимоотношения геномной ДНК и липидов и влиянияна них факторов внешнего воздействия среды (Дьячков и др., 2011; Жданов идр., 2014а,б,в; 2015; Ибрагимова и др., 2012а,б; 2013; 2014а; Тарасов и др.,2012).Все поставленные в настоящей работе задачи выполнены.
Впервыепроведено исследование структуры и свойств комплексов между липидами иДНК; определено влияние на них факторов среды (температура, фазы роста,лекарственные препараты) для изучения взаимосвязи нестабильностигеномной ДНК и модуляторов липидного обмена.Впервыенамипроведенасравнительнаяхарактеристикажирнокислотных маркеров общих липидов грамположительной Bacillussubtilis OSU_142 и грамотрицательной Pseudomonas aurantiacа В-1558бактерий в зависимости от влияния факторов внешнего воздействия –температуры (от 24 до 39 оС) и фазы роста (логарифмическая, стационарная).Предложено использовать в качестве маркера фазы роста Bacillus subtilisвеличину отношения 15:0 антеизо / 17:0 антеизо кислот, а в качестветемпературного маркера дляBacillus subtilis – величину отношения 15:0изо/17:0 изо, а для Pseudomonas aurantiacа – соотношение содержания 16:0 /18:1ω7c кислот (Жданов и др., 2012; Ибрагимова и др., 2012а).
Показано, чтоосновнымикомпонентамижирнокислотногопрофиляДНК-связанныхлипидов препарата геномной ДНК Pseudomonas aurantiaca, выделенногодетергентным методом, являются кислоты 16:0 и 18:0 (Жданов и др., 2012).Определены жирные кислоты и липиды, входящие в состав прочно- ислабосвязанной с ДНК фракции липидов.Предложен новый способ качественного и количественного анализалипидов, прочносвязанных с геномной ДНК, на который получен патент.177Данный способ позволяет определить жирнокислотный состав ДНКсвязанных липидов, которые остаются после независимой обработки ДНКгидролизующими ферментами (или ДНКазой I, или РНКазой А, илипротеиназой К).
Анализ липидов включает следующие основные стадии:1) выделение из клеток ДНК, с которой связаны липиды надмолекулярногокомплекса, с помощью детергентов; 2) гидролиз ДНК (супрамолекулярногокомплекса: ДНК, РНК, белки и липиды) гидролизующими ферментами;3) выделение липидов, определение их жирнокислотного состава с помощьюгазовогохроматографа.Предложенныйспособопределенияжирнокислотного состава ДНКсвязанных липидов может быть использованприразработкеновыхметодовдиагностикизаболеванийпожирнокислотному (липидному) составу ДНК˗связанных липидов пациентаили создании новых типов лекарственных средств (Жданов и др., 2014а).Комплексы ДНК и клеточных мембран прокариот были известны с1970-х годов. Ученым ещё предстоит исследовать функции большогоразнообразия липидов клеточного ядра (Albi, Magni, 2004; Alesenko,Burlakova, 2002).
Специалисты, выделявшие препараты геномной ДНК,знают, как много там содержится липидов и как трудно от них избавиться.Большинство липидов удаляется фенольной обработкой, которая, однако,может привести к артефактам, связанным с переносом на ДНК мембранныхлипидов. Липиды хроматина частично связаны непосредственно с ДНК(Стручков, Стражевская, 1993), часто настолько прочно, что даже послевыделения геномной ДНК в присутствии детергентов ее образцы содержатлипиды, как это показано для геномной ДНК прокариот (Zhdanov et al., 2006).Роль ДНК-связанных липидов в функционировании хроматина и ядранеобходимо изучать более детально, однако определенные результаты ужеполучены.
В частности, известен факт увеличения количества ДНКмембранныхконтактовумикроорганизмов,выделенныхизводы,охлаждающей атомные энергетические установки, получивших название178Microccocus (Deinococcus) radiodurans. Таким образом, микробы защищаютсвой геном от ионизирующего излучения образованием комплексов ДНК смембранами.Широкоизвестноизучаемоеиобсуждаемоесейчасбиологическое действие малых доз радиации (Бурлакова и др., 2003). Одиниз парадоксов здесь заключается в том, что они могут вызыватьзначительные повреждения геномной ДНК. Одно из объяснений этомуявлению заключается в том, что ионизирующее излучение действует сначалана двойные связи ДНК-связанных липидов и инициирует образованиесвободных радикалов, которые и разрушают ДНК in situ (Стручков,Стражевская, 1993). Остается актуальным для исследований вопрос о ролилипидов в передаче сигнала и регуляции экспрессии генов (Wassarman,Wolffe, 1999), хотя в этой области накоплено достаточно данных о регуляцииэкспрессии генов полиненасыщенными жирными кислотами (Kamath-Loeb etal., 2014).
Известно, в частности, что полинасыщенные жирные кислоты(ПНЖК), линоленовая, арахидоновая и эйкозапентаеновая кислоты являютсяингибиторами пролиферации клеток.В настоящем исследовании представлен подход к изучению липидногосостава ДНК-связанных липидов прокариотической клетки методом массспектрометрии с использованием электроспрей ионизации (ESI-LC-MS).Впервые обнаружено, что для обеих фракций ДНК-связанных липидовхарактерно наличие фосфатидилглицерина, фосфатидилсерина и лизофосфатидилинозитола. В слабосвязанной (спирторастворимой) фракцииДНК-связанных липидов могут содержаться также фосфатидилхолин ифосфатидилинозитол,авофракциипрочносвязанныхлипидов–триацилглицериды и кардиолипин.В работе обсуждена специфичность взаимодействия жирных кислот ифосфолипида с ДНК и показаны особенности их расположения в малойбороздке ДНК, исходя из их структурных особенностей (Дьячков и др., 2011;Жданов и др., 2014в; Тарасов и др., 2012).
Согласно нашим представлениям179специфичность липид-нуклеиновых взаимодействий может выражаться всуществовании ДНК-липидных взаимодействий, в которых жирные кислоты(липиды)связываютсясДНКвзависимостиотнуклеотиднойпоследовательности. Это обстоятельство может играть важную роль прирассмотрении вопросов регуляции экспрессии генов, передачи сигнала истабилизацииопределенныхучастковгенома,вчастностиCG-динуклеотидных повторов в некодируемых областях генома. Оно может бытьважным и при исследовании передачи сигнала от клеточной мембраны вгеномную ДНК, поскольку липиды там уже имеются, а важным классоммедиаторов передачи сигнала являются гидрофобные молекулы липиднойприроды.
В стабилизации комплекса жирной кислоты и ДНК важную рольиграютводородныесвязи,ван-дер-ваальсовыигидрофобныевзаимодействия, что было нами продемонстрировано в экспериментах in silico(Дьячков и др., 2011; Жданов и др., 2014в; Тарасов и др., 2012; Michanek et al,2012).Результаты наших компьютерных экспериментов согласуются спредложенной нами концепцией о том, что существующие в препаратахгеномной ДНК прочносвязанные липиды, взаимодействующие с ней взависимости от последовательности нуклеотидов, могут составлять новыйинформационный уровень геномной ДНК (Жданов и др., 2014в; Тарасов идр., 2012). Также нами получено бóльшее значение энергии связи длясвязывания линолевой кислоты с ДНК, чем для связывания олеиновойкислоты (Дьячков и др., 2011), которая используется для полученияфосфолипида-помощника диолеилфосфатидилэтаноламина.
Таким образом,для получения более высокой эффективности при переносе генов вгенотерапии перспективнее использовать липид-помощник с остаткомлинолевой, а не олеиновой кислоты (Тарасов и др., 2012).Намибылоустановлено,какимобразомразныелигандыадренорецепторов через модификацию аденилатциклазной системы, которая180является мессенджером (посредником) в реализации самых разнообразныхбиохимических процессов с участием липидов, влияют на развитиегенетическогостресса.адренокортикотропныйВсегормон,трисистемыглюкокортикоиды),(катехоламины,участвующиевреализации стресса, стимулируют липолиз.
Распад липидов происходит поддействиемлипаз,фосфолипаз,приэтомактивируютсяпроцессы,запускающие перекисное окисление жиров. При длительном стрессе эти трифактора «липидная триада» способствуют повреждению клеток.В работе мы определяли мутагенный и антимутагенный эффектылигандов адренорецепторов ‒ модуляторов липидного обмена, механизмдействия которых хорошо изучен и реализуется через систему вторичныхпосредников (цАМФ) (Гайнуллина, 2000; Ибрагимова и др., 2011а,б; 2014а).Выявлено, что при использовании микроядерного анализа, стимуляторы иблокаторы адренорецепторов снижают мутагенный эффект лекарственногосредства циклофосфамида в эритроцитах периферической крови мышей(Ибрагимова и др., 2014а). Известно, что лиганды адренорецепторов поразному действуют на мутагенез, индуцированный различными мутагенами врамках рецепторно-регуляторного механизма (Семенов, 1997).
Очевидно, чтомеханизмынестабильностигеномнойДНК,вызванныеразличнымимутагенами, отличаются. Выбор лекарственного препарата способногопроявлятьантимутагенныйфармакологическойэффектконцепциииможетзнанийопределятьсяомеханизмахнаосноведействияантимутагенов (Гайнуллина, 2000; Ибрагимова и др., 2011а,б; 2014а).Установлено, что циклофосфамид, приводящий к нестабильностигенома, приводит к лабильности липидома (перекисное окисление липидов) ибиоэлементов в гомогенатах органов крыс.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
