Автореферат (1150275), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Мешающее влияние сульфит-ионов,присутствующих в инъекционных лекарственных формах в качестве консерванта, устранялипри подкислении проб с последующим удалением диоксида серы при пропускании аргона черезраствор.9Были проанализированы инъекционные лекарственные формы, содержащие эпинефринпо схеме, представленной на рисунке 4 и методом высокоэффективной жидкостнойхроматографии (ВЭЖХ). Результаты, полученные по разработанной и референтной методикам,сравнивали при помощи F- и t-тестов (Таблица 2). Полученные F-значения ≤ 6,39 указывают нанезначительное различие в величинах стандартных отклонений, а t-значения ≤ 2,31 указываютна отсутствие статистически значимого различия между результатами, полученными по двумметодикам.Таблица 2.
Результаты определения эпинефрина в инъекционных лекарственных формах(n1 = 5, n2 = 5, P = 0,95).ПробаСертифициНайдено, мг/млFtрованноетесттестМезофлюидноеВЭЖХсодержание,устройство ЦИАмг/млАдреналингидрохлорид1,000,972±0,0590,985±0,0553,780,16(Московскийэндокринный завод)Адреналин1,821,796±0,0611,803±0,0562,501,86гидротартрат(«Здоровье», Украина)Определение цистеина. Для фотометрического определения цистеина была также изученавозможность использования 18-МФА.
Для установления стехиометрии реакциивосстановления 18-МФА цистеином и состава восстановленной формы 18-МФА использовалиметоды молярных отношений и изомолярных серий. Было выявлено образованиедвухэлектронной восстановленной формы 18-МФА, а соотношение аналит:реагент составило2:1. Окислительно-восстановительная реакция, протекающая между 18-МФА и цистеином,описывается следующим уравнением:Продуктом реакции 18-МФА с цистеином является двухэлектронная восстановленнаяформа (P2MoVI16MoV2O62)8-.Молярный коэффициент светопоглощения составил 6·103 л моль-1∙см-1 при λmax=820 нм.Полнота протекания реакции между 18-МФА и цистеином также в большой степени зависит отрН-раствора.
При рН>7,5 (Рисунок 6 а) исходный гетерополикомплекс (18-МФА) подвергаетсягидролизу, а при рН<4,5 аналитическая реакция кинетически замедлена. Максимальнаяоптическая плотность раствора аналитической формы наблюдается в диапазоне рН от 5 до 7,5.При рН=7,5 аналитическая форма со временем разрушается, к тому же усиливается гидролизсамого реагента (18-МФА). Поэтому в качестве оптимального значения рН было выбранозначение рН=5,0.
На следующем этапе проводили выбор оптимальной концентрациифотометрического реагента 18-МФА. Согласно полученным данным (Рисунок 6 б)оптимальная концентрация реагента – 0,4 мМ.10Рисунок 6. Зависимость оптической плотности восстановленной формы 18-МФА от рНраствора (а) и от концентрации реагента (б).Для циклического инжекционного спектрофотометрического определения цистеинаиспользовали аэрогидравлическую схему, представленную на рисунке 4.
C помощьюшприцевого насоса (1) через многоходовой кран-переключатель (2) в удерживающий канал (3)последовательно отбирали 10 мкл 0,4 мМ раствора 18- МФА, 10 мкл раствора пробы и 10 мклацетатного буферного раствора (рН=5,0). Растворы из удерживающего канала (3) при смененаправления движения поршня шприцевого насоса (1) перекачивали в реакционную емкостьмезофлюидного устройства (4), где происходило их перемешивание. После этого при помощиперистальтического насоса (5) раствор перекачивали в оптический канал, в которомпроизводили измерение оптической плотности. Далее выполняли промывку коммуникацийбуферным раствором и измеряли оптическую плотность «холостой» пробы.Было также изготовлено мезофлюидное устройство, функционирующее на принципахпроточно-инжекционного фотометрического анализа (Рисунок 7), и было проведено сравнениевозможностей двух устройств при определении цистеина.
Мезофлюидное устройство ПИАбыло изготовлено из ПММА с применением фрезерной технологии.Рисунок7.Топологиямезофлюидногоустройства для миниатюризации проточноинжекционного фотометрического анализа: 1 –канал для ввода буферного раствора и пробы; 2– канал для ввода раствора реагента; 3 – канал,выполненный в форме меандра; 4 – оптическийканал; 5 – отверстие для источника света; 6 –линза; 7 – светодиод; 8 – спектрометр, 9 – сброс.Топология мезофлюидного устройства для миниатюризации проточно-инжекционногофотометрического анализа включает в себя четыре основных канала: каналы для вводарастворов пробы и реагента (1, 2); канал, выполненный в форме меандра (3), предназначенныйдля смешения растворов пробы и реагента и образования аналитической формы в потоке;оптический канал (4), в котором происходило измерение оптической плотности (длинаоптического пути 36 мм). В качестве источника света использовали светодиод, перед которымразмещали шарообразную линзу для усиления фокусировки света на оптический канал.
Вкачестве детектора использовали аналогичный портативный спектрометр, оптоволоконныйкабель которого был закреплен на устройстве.11Проточно-инжекционное определение цистеина проводили согласно схеме,представленной на рисунке 8. Шприцевые насосы (1, 2) заполняли ацетатным буфернымраствором и 0,4 мМ раствором 18-MФA, затем в каналы мезофлюидного устройства (3)подавали со скоростью 0,5 мл/мин соответствующие растворы. В канале, выполненном в формемеандра, смешивались растворы 18-MФA и буферный раствор. Смешанный раствор черезоптический канал поступал на сброс, при этом измеряли фоновый сигнал. Через каждые 5секунд кран-дозатор (4) менял свое положение, и в поток ацетатного буферного раствораинжектировали раствор пробы с помощью перистальтического насоса (5).
Важным параметромв ПИА является объем инжектируемой пробы, от которого зависит и дисперсия, и величинааналитического сигнала. В поток ацетатного буферного раствора инжектировали от 30 до 120мкл 0,1 мМ раствора цистеина. Установлено, что с увеличением объема пробы аналитическийсигнал возрастает, и достигает максимального значения при объеме пробы 100 мкл, который ибыл выбран для дальнейших исследований. После инжектирования пробы в каналемезофлюидного устройства образовывалась аналитическая форма, оптическая плотностькоторой пропорциональна концентрации цистеина.Рисунок8.Аэрогидравлическая схема для проточноинжекционного определенияцистеина: 1, 2 – шприцевыенасосы; 3 – мезофлюидноеустройство; 4 – кран-переключатель; 5 – перистальтический насос; 6 – спектрометр.Аналитические характеристики методик определения цистеина по реакции с 18-МФА,реализованных в мезофлюидных устройствах (МУ) ЦИА и ПИА, представлены в таблице 3.Чувствительность проточно-инжекционного определения цистеина уступает ЦИА из-задисперсии пробы (коэффициент дисперсии равен 2) в потоке носителя.
ЦИА уступает попроизводительности ПИА, что далеко не во всех случаях применения автоматизированныхметодик анализа может считаться недостатком. Необходимость анализа сотен проб возникаетв определенных случаях, например, при непрерывном экологическом мониторинге водныхсред. В большинстве возможных областей применения подобных методик требуетсяпроизводительность на уровне десятков образцов в смену, что легко обеспечивает ЦИА.Следует отметить, что мезофлюидное устройство ЦИА позволило сократить в 10 разсуммарный расход реагентов на одно определение по сравнению с устройством ПИА.
Крометого, топология мезофлюидного устройства ЦИА является универсальной – не зависит отколичества используемых растворов реагентов. Топология мезофлюидных устройств ПИА, какправило, индивидуальная и зависит от особенностей автоматизируемой методики анализа.12Таблица 3. Аналитические характеристики проточных фотометрических методикопределения цистеина.ХарактеристикиМезофлюидное МезофлюидноеустройствоустройствоЦИАПИАОбъем пробы, мкл1050Объем раствора 18-МФА, мкл10125Объем буферного раствора, мкл10125Суммарный расход реагентов на один анализ, мкл30300Предел обнаружения, µМ (3σ)36Диапазон определяемых концентраций, µМ10 – 10020 – 100Коэффициент корреляции0,9970,991СКО (n=5), %4,95,2Производительность, проб/час12240Мешающее влияние при определении цистеина по реакции с 18-МФА оказываютсоединения, проявляющие восстановительные свойства. Существенное влияние оказываетаскорбиновая кислота при содержании 0,02 мМ и выше.Разработанные методики были испытаны при определении цистеина в биологическиактивных добавках.
В качестве референтного метода использовали ВЭЖХ. Результаты,полученные по разработанной и референтной методикам, сравнивали при помощи F- и t-тестов(Таблица 4). Полученные F-значения ≤ 6,39 указывают на незначительное различие в величинахстандартных отклонений, а t-значения ≤ 2,31 указывают на отсутствие статистически значимогоразличия между результатами, полученными по разработанным и референтной методикам.Таблица 4. Результаты определения цистеина в биологически активных добавках(n1 = 5, n2 = 5, n3 = 5, P = 0,95).ПробаСертифици-Найдено, грованноесодержание,МУ ЦИАМУ ПИАВЭЖХгМУ ЦИА иМУ ПИА иВЭЖХВЭЖХF-t-F-t-тесттесттесттест«Nowfoods»0,50,491 ± 0,0610,487 ± 0,0650,492 ± 0,0541,270,292,600,620,50,493± 0,0590,489 ± 0,0640,495± 0,0552,780,734,181,11(США)«Twinlab»(США)Глава 4.
Миниатюризация циклического инжекционного флуориметрическогоанализаМезофлюидное устройство для миниатюризации циклического инжекционногофлуориметрического анализа было изготовлено из трех комбинированных пластинок ПММА сиспользованием фрезерной технологии. Схема изготовления представлена на рисунке 9.Каждая ПММА пластинка состояла из двух частей: прозрачной (50 × 20 × 10 мм) и черной,непрозрачной (50 × 50 × 10 мм).
Прозрачную и черную части склеивали с торцевой стороны13(Рисунок 9.1). После склеивания две комбинированные ПММА пластинки совмещали вместе(Рисунок 9.2) и в верхней грани просверливали коническое отверстие – реакционную емкость(диаметр 6 мм, глубина 28 мм) (Рисунок 9.3). В правой и левой торцевых гранях просверливалидва отверстия (диаметр 10 мм, глубина 20 мм) для светодиодов (Рисунок 9.4). После этогопластинки разъединяли и в центре черной части пластинки А изготавливали углублениеквадратной формы (25 × 25 × 5 мм) для фиксации светофильтра (Рисунок 9.5). Междуотверстиями для светодиодов просверливали отверстие (диаметр 4 мм, глубина 10 мм) дляокошка детектора фотоумножительной трубки (Рисунок 9.6). В черной части пластинки Бизготавливали три прямых канала: один канал (длина 42 мм) от окончания коническогоотверстия до нижней грани пластинки и два канала (длина 20 мм), соединенных с коническимотверстием с правой и левой сторон (Рисунок 9.7).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
